2．Chadwick 氏法
�。�1)材料：抗原球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%重碳酸鈉水溶液、0.01mol/l Ph8.0磷酸鹽緩沖鹽水、1%硫柳汞、離心機(jī)及離心管、三角燒瓶（25ml)、冰槽、無菌吸管及毛細(xì)滴管、燒杯（500ml)、透析袋、棉線、玻棒等。
�。�2)方法及步驟：
�、倏贵w準(zhǔn)備：用0～4℃pH8.0磷酸鹽緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg/ml，置入三角燒瓶?jī)?nèi)，放于冰槽中。
�、跓晒馍販�(zhǔn)備：按每毫克蛋白加入熒光素0.01mg計(jì)算，稱取所需之熒光素量，用3%重碳酸鈉水溶液溶解。
③將準(zhǔn)備之抗體與熒光色素溶液等量混合，充分?jǐn)噭颍?～4℃，冰箱中結(jié)合18～24h。
④透析和柱層析：方法同Marshall 氏法。
3．改良法（1963年) 根據(jù)Marshall 氏法取高價(jià)的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水（0.15mol/l NaCl)及緩沖液（0.15mol/l NaHCO3 –Na2CO3 PH9.0) 稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白10mg,緩沖液為總量的10%，降溫至4℃，加入異硫氰酸鹽熒光素，（蛋白：熒光素=50～80mg:1mg)，在0～4℃下電磁攪拌12～14h。然后用半飽和和硫酸銨將標(biāo)記球蛋白沉淀分離，除去未結(jié)合的熒光素，再用緩沖鹽水透析，除去硫酸銨（用Nessler氏試劑測(cè)驗(yàn)至隔夜透析之鹽水無氨離子及熒光色素為止)。將制備好的熒光抗體加疊氮鈉0.01%,分裝在1ml安瓿中，或凍干，保存于冰箱中（4℃)可以用半年以上，-20℃保存可達(dá)2年以上。
【附一】0.01mol/L pH7.2 PBS 配法：NaCl 18g 、Na2HPO41.5g、KH2PO40.2g,溶于2000ml蒸餾水中，校定pH至7.2。
【附二】0.5mol/L pH9.0碳酸鹽緩沖液配法：取0.5mol/l Na2CO3(5.3%)10ml加入0.5mol/l NaHCO3(4.2%)90ml,混合后，校定pH至9.0。
【附三】3%重碳酸鈉水溶液配法：稱1.5g無水重碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。
4．透析標(biāo)記法 此法適用于小量抗體的熒光素標(biāo)記，標(biāo)記簡(jiǎn)便，非特異性染色較少。
（1)用0.025mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0，將欲標(biāo)記免疫球蛋白稀釋成1%濃度，裝入透析袋中。
�。�2)用同一緩沖液將FITC配成0.1mg/ml的溶液，按1%球蛋白液體積的10倍，將FITC稀釋液盛于圓柱形容器內(nèi)，并使透析袋浸沒于FITC液中。容器頂端蓋緊，底部放攪拌棒，在4℃電磁攪拌下，透析標(biāo)記24h。取出透析袋中標(biāo)記液，即刻用sephadex G-50 凝膠過濾，去除游離熒光素，分裝、貯存于4℃中（圖3-13)。
圖3-13 標(biāo)記抗體溶液通過sephadex 產(chǎn)膠柱層析分布
�。ǘ�)四乙基羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法
取1g RB200及PCL52g放在乳缽中研磨5min（在通風(fēng)櫥中)。然后加入10ml無水丙酮，放置5min，不斷攪拌。過濾，用濾液進(jìn)行標(biāo)記抗體。剩余部分吸附在濾紙上，4℃干燥保存。
取抗體（20mg/ml)每毫升加入生理鹽水和0.5mol/l pH9.0的碳酸鹽緩沖液各1ml稀釋。逐滴加入0.1ml RB200溶液，邊加入邊攪拌，在0～4℃中結(jié)合12～18h，再用生理鹽水透析5～7h，經(jīng)葡聚糖凝膠G-50柱層析，除去游離熒光素，分裝，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/P>
�。ㄈ�)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明標(biāo)記抗體方法
�。�1)Igg 10ml (6mg/ml)在0.01mol/l pH9.5碳酸鹽緩沖液中透析過夜。
�。�2)將四甲基異硫近氰酸羅達(dá)明（每毫克IgG加入5～20μg)溶于二甲亞砜（1mg/ml),取此溶液300μl，一滴一滴加入蛋白質(zhì)溶液中，同時(shí)電磁攪拌。
（3)在室溫中攪拌2h，避光。
�。�4)把結(jié)合物移入直徑3cm,高30cm大小的Bio –Gel P-6層析柱（用0.01mol/l pH8.0的PBS平衡過)，流速為1.5ml/min。
�。�5)收集先流出的紅色結(jié)合物，即為標(biāo)記抗體，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?/P>
