 |
 |
1.3 用MTT 法測定用 MTT 法測定地塞米松不同濃度條件下，腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞的光吸收值（OD 值)MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。光吸收值（OD 值)，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，不同生長條件下OD 值可以反應(yīng)該條件下細(xì)胞的生長活性。原代培養(yǎng)的EPM 細(xì)胞，計數(shù)后以5×104 個細(xì)胞/孔接種到96 孔板。培養(yǎng)72h 后，吸去原培養(yǎng)基，試驗組四個，分別加入濃度為1×10－6mol/l，1×10－7mol/l，1×10－8mol/l，1×10－9mol/l 地塞米松的培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置三個復(fù)孔。對照組，三個復(fù)孔，繼續(xù)添加不含地塞米松的原培養(yǎng)基，將96 孔板放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，從第1 天開始應(yīng)用MTT 法檢測各組細(xì)胞OD 值，連續(xù)檢測5 天。將每天各組OD 值取平均數(shù)后，繪制曲線以及計算各組抑制率（抑制率=1-加藥組OD 值/對照組OD值)。上述步驟重復(fù)3 次，將檢測得到的各濃度組不同培養(yǎng)時間的OD 值分別計算均數(shù)，采用SPSS 軟件，進(jìn)行統(tǒng)計分析。醫(yī).學(xué).全.在.線網(wǎng)站提供。
1.4 不同濃度地塞米松對腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞凋亡的檢測原代培養(yǎng)的 EPM 細(xì)胞，計數(shù)后以5×104 個細(xì)胞/孔接種到6 孔板。培養(yǎng)72h 后，吸去原培養(yǎng)基，試驗組四個孔，分別加入濃度為1×10－6mol/l，1×10－7mol/l，1×10－8mol/l，1×10－9mol/l 地塞米松的培養(yǎng)基1500ul。對照組，兩個孔，繼續(xù)添加不含地塞米松的原培養(yǎng)基1500ul。
繼續(xù)培養(yǎng)72 小時，吸取原培養(yǎng)基，用PBS 快速洗細(xì)胞爬片兩遍后，4%中性多聚甲醛常溫固定15～20min。CMF-PBS 液室溫下振蕩洗3 次（5min/次)。每孔滴加碘化丙啶（PI)4~5 滴。
2 結(jié)果
2.1 小鼠胚胎腭突間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及生物學(xué)特性鑒定采用酶消化法獲得的原代細(xì)胞，最初接種的細(xì)胞在顯微鏡下為折光性強的小圓形，懸浮狀態(tài)。20 min 后開始貼壁，24 h 后， 絕大部分細(xì)胞貼壁，倒置相差顯微鏡下可見，圓形細(xì)胞胞質(zhì)逐漸展開，折光性減弱，完全鋪展后細(xì)胞為細(xì)長梭形或星形，有2～4 個突起，胞漿透明，胞核大，呈圓形或橢圓形，有1～4 個核仁。HE 染色可見EPM 細(xì)胞核成藍(lán)紫色，胞漿成紅色，細(xì)胞成長梭形或星形，核仁大且明顯。EPM 細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色顯示Vimentin胞漿黃染，表達(dá)較強，核藍(lán)色；胞漿內(nèi)未見CK 陽性表達(dá)。
2.1 地塞米松對腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞增殖的劑量－效應(yīng)關(guān)系隨著 Dex 濃度的降低，EPM 細(xì)胞OD 值增高。第1 天各濃度梯度與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義；第2、3、4 天前三個濃度有統(tǒng)計學(xué)意義；第5 天只有前兩組與對照組有統(tǒng)計學(xué)意義。而所有5 天Dex 濃度為1×10－6mol/l 組的P 值大多<0.01。
2.2 不同濃度地塞米松對腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞增殖的時間－效應(yīng)關(guān)系地塞米松作用后第1、2 天，增殖尚不活躍，各加藥組間無明顯的差異（P>0.05)。從第3 天開始，各濃度組與對照組間OD 值明顯拉開距離，第4、5 天，各組的變化都趨于穩(wěn)定。隨著時間的延長，各濃度組生長的曲線基本呈現(xiàn)S形，與對照組相仿，但地塞米松組細(xì)胞的增殖活躍程度明顯低于對照組。
