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KEY WORDS: hepatitis B virus; genotype; microboard nucleate molecular hybridization; function of liver
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后的臨床過程多種多樣,除了與宿主的免疫狀況、感染方式等有關(guān),與感染病毒株的基因型種類也關(guān)系密切。不同基因型的HBV代表著在生物學(xué)特性方面的差異，HBV基因分型有助于對(duì)病情、治療及預(yù)后的評(píng)價(jià)。目前各地區(qū)的檢測方法不同，研究的結(jié)論不盡相同。我們采用微板核酸雜交ELISA技術(shù)進(jìn)行基因分型，并同時(shí)測定肝功能，評(píng)價(jià)其對(duì)肝功能的影響。
1 材料與方法
1.1 臨床資料
93例患者均來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染科2005年6月～2005年11月住院患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》，所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒混和感染及其他原因引起的肝炎，既往未曾進(jìn)行抗病毒治療。其中亞急性重型肝炎4例，慢性乙型肝炎中度25例，重度24例，乙肝肝硬化28例，肝癌12例，男70例，女23例，年齡19～68歲，平均年齡42.40歲。所有血液標(biāo)本均新鮮分離血清，-25℃保存，待整批檢測。
1.2 試劑和儀器
HBV基因分型PCR微板核酸分子雜交ELISA試劑盒由第一軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物醫(yī)學(xué)診斷研究中心提供。DG3022A型酶標(biāo)儀為國營華東電子管廠生產(chǎn)。9700型基因擴(kuò)增儀為美國PE公司生產(chǎn)。
1.3 檢測方法
1.3.1 采用微板核酸雜交ELISA技術(shù)進(jìn)行基因分型
①引物及探針：根據(jù)HBV 6個(gè)基因型的特異基因序列，選擇前C區(qū)的不同序列作為PCR引物和核酸雜交探針，6個(gè)基因型通用的序列作為PCR的引物和通用包被探針，而同一部位的不同序列作為各型的顯色探針，并采用Primer軟件設(shè)計(jì)引物和探針。顯色探針5標(biāo)記Biotin由上海生物工程有限公司合成。序列為：引物W1：CCCTTCTTCGTCTCGCGGTTCC(nt 1490～1510);引物W2：ACCAATTTATGCCTACAGCCTC(nt 1798～1777)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站m.payment-defi.com。
②HBVDNA的提取及擴(kuò)增：取處理液100μL于0.5mL離心管內(nèi)，加待測血清100μL，混勻，100℃煮沸15min，12000r/min離心5min，取上清液作為擴(kuò)增模板。取上清液12μL于反應(yīng)液管內(nèi)，彈勻，10000r/min離心10s，上機(jī)循環(huán)，預(yù)變性94℃ 2min，循環(huán)條件：94℃ 50s、55℃ 50s、72℃ 65s，共循環(huán)38次，最后72℃延伸3min。
③微板雜交及酶聯(lián)顯色：將擴(kuò)增產(chǎn)物98℃變性10min，迅速冰浴10min。各取雜交液90μL，各型顯色探針25μL，已變性產(chǎn)物20μL，分別加入反應(yīng)孔內(nèi)，輕輕混勻，50℃水浴60min。輕輕棄去上清液后加入200μL雜交洗液，50℃洗滌3～5min，共3次。每孔中加入100μL酶抗體，37℃孵育30min后，輕輕棄去上清液，加入200μL酶洗液，置37℃ 3～5min，再重復(fù)洗2次。每孔加顯色劑A、B各1滴，避光，置37℃ 10min后加入終止液1滴，在450nm波長處檢測A值。
④結(jié)果判斷：P/N≥3.0為HBVDNA陽性，P/N<3.0為陰性(陰性對(duì)照A值小于0.05，按0.05計(jì)算：P/N比值=標(biāo)本A值/陰性對(duì)照A值)。
