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1.2 細(xì)胞培養(yǎng)
人宮頸癌HeLa細(xì)胞株為西安交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心提供，培養(yǎng)于含100mL/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于含50mL/L CO2、飽和濕度和37℃條件下培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為5×104/mL。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為對照組和處理組。處理組分為0.125、0.25、0.5和1mmol/L PE 4組。細(xì)胞在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，用含有不同濃度PE的培養(yǎng)基更換并繼續(xù)培養(yǎng)到測試時(shí)間。
1.4 細(xì)胞增殖檢測
用MTT法測定。選用對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總液量200μL。接種第2天換處理培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到測試時(shí)間前4h，每孔加入MTT液20μL，37℃、50mL/L CO2下繼續(xù)孵育至測試時(shí)間，棄上清液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩5min，在高通量多功能微板測試系統(tǒng)波長490nm下測定每孔光的吸光度值(A490)醫(yī).學(xué)全.在.線m.payment-defi.com。
1.5 細(xì)胞周期分析
選用對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，以5×104/mL的細(xì)胞密度接種于24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔總液量1mL。處理同前，消化、固定并收集細(xì)胞，每孔細(xì)胞加PI(100mg/L)染液100μL，避光，37℃孵育30min，上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果用隨機(jī)軟件分析。
1.6 細(xì)胞凋亡檢測
使用AnnexinPI法。消化后，細(xì)胞用冷PBS洗2次，調(diào)整濃度到1×105/mL。取100μL細(xì)胞，并加入5μL FITCAnnexin V及5μL PI(濃度250mg/L)，混勻后置于冰浴上閉光孵育10min，在BD公司流式細(xì)胞儀檢測，光源為488nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光，結(jié)果用隨機(jī)軟件分析。
1.7 統(tǒng)計(jì)分析
用SPSS11.0軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗(yàn)。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 PE抑制HeLa細(xì)胞生長
PE作為細(xì)胞膜的重要成分，具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性的作用。外源PE可以顯著地抑制HeLa細(xì)胞生長，并呈時(shí)間和劑量依賴性。對照組HeLa細(xì)胞呈三角形或多角形，細(xì)胞輪廓清晰，立體感較強(qiáng)。PE處理48h后，細(xì)胞發(fā)生變形，立體感降低，細(xì)胞輪廓趨于模糊;在高濃度時(shí)，圓形細(xì)胞增多(圖1A)。在PE處理72h時(shí)，0.5和1mmol/L濃度各組細(xì)胞生長抑制持平(圖1B)。各處理組與對照組之間均存在顯著性差異(P<0.01)。
2.2 PE不影響HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞周期
細(xì)胞生長抑制受細(xì)胞增殖周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響。在PE抑制細(xì)胞生長的過程中，未觀察到細(xì)胞增殖周期的阻滯。PE處理組在G1/G0、S和G2/M的細(xì)胞分布與對照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)，表明PE不影響細(xì)胞增殖周期(圖2)。
2.3 PE誘導(dǎo)了HeLa細(xì)胞的凋亡
應(yīng)用AnnexinPI法測定了PE處理24h的HeLa細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示，0.125mmol/L PE已具有誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，隨著PE濃度的增加，細(xì)胞凋亡隨之升高。0.5mmol/L和1mmol/L PE分別在早期凋亡和晚期凋亡達(dá)到高峰(圖3)。
