 |
 |
生物體表現(xiàn)出的各種特性，主要是由基因的差異表達(dá)引起的，這種表達(dá)的變化是調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)過(guò)程的核心機(jī)制，通過(guò)比較同一類細(xì)胞在不同生理?xiàng)l件下或在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的基因表達(dá)差異，可為分析生命活動(dòng)過(guò)程提供重要信息。在研究WP3在不同鹽濃度，溫度中的基因差異表達(dá)時(shí)，它的全基因組測(cè)序工作還正在進(jìn)行之中，當(dāng)時(shí)在對(duì)WP3基因組序列了解不多的情況下選用了原核生物特異的差異顯示研究方法——RNA隨機(jī)引物PCR(RAP_PCR)[6_7]。與文獻(xiàn)報(bào)道一樣[8]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，測(cè)序膠電泳后出現(xiàn)差別條帶太多，假陽(yáng)性率高達(dá)70%左右，重復(fù)性差，且對(duì)高豐度的RNA具很強(qiáng)的傾向性。在有差異的顯示片段中難以知道哪些基因是已知的，哪些是未知的。本次實(shí)驗(yàn)得到的有差異的擴(kuò)增條帶短(110～450bp)。如何有效的從備選的差異片段中進(jìn)一步驗(yàn)證真正差異表達(dá)的基因是很重要的。作者分別用3種方法驗(yàn)證了從變性長(zhǎng)膠聚丙烯酰胺凝膠電泳得到的片段，結(jié)果表明，RT_PCR靈敏性最強(qiáng)，RNA點(diǎn)雜交需要的RNA量最大，熒光實(shí)時(shí)定量PCR精確性最高。因此，在實(shí)驗(yàn)條件允許下，用熒光實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)較少片段的驗(yàn)證較好，此法需要的RNA樣品少，基因差異表達(dá)的變化可以量化。
【參考文獻(xiàn)】
[1]WANG F, WANG P, CHEN M, et al. Isolation of extremophiles with the detection and retrieval of Shewanella strains in deep sea sediments from the west Pacific[J]. Extremophiles, 2004, 8: 165-168.
[2]LIANG P, PARDEE A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J]. Science, 1992, 257(5072): 967-971.
[3]LIANG P, AVERBOUKH L, PARDEE A B. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display: refinements and optimization[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(14): 3269-3275.
[4]FISLAGE R, BERCEANU M, HUMBOLDT Y, et al. Primer design for a prokaryotic differential display RT_PCR[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25: 1830-1835.
[5]MALHOTRA I, DENT A, MUNGAI P, et al. Real_time quantitative PCR for determining the burden of Plasmodium falciparum parasites during pregnancy and infancy[J]. J Clin Microbiol, 2005, 43(8): 3630-3635.
[6]BENSON N R, WONG R M, MCCLELLAND M. Analysis of the SOS response in Salmonella enterica serovar typhimurium using RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR[J]. J Bacteriol, 2002, 182: 3490-3497.
[7]BIDLE K A. Differential expression of genes influenced by changing salinity using RNA arbitrarily primed PCR in the archaeal halophile Haloferax volcanii[J]. Extremophles, 2003, 7: 1-7.
[8]NAGEL A, FLEMING J T, SAYLER G S. Reduction of false positives in prokaryotic mRNA differential display[J]. Biotechniques, 1999, 26: 641-643.
