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12實(shí)驗(yàn)動物分組及造模48只成年豚鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物質(zhì)量合格證號:0031706)。所有豚鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、經(jīng)皮給藥藥貼組和地塞米松組，每組各12只�？刂剖覝兀鹘M在相同條件下飼養(yǎng)，先將動物飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境后開始造模。第4天，除正常對照組外，其他各組均采用雞卵白蛋白致敏，常規(guī)消毒后一次性腹腔注射100 g/L卵白蛋白生理鹽水1 mL，使豚鼠處于致敏狀態(tài)[6]。第18天開始，將致敏的豚鼠置于密閉透明的塑料盒內(nèi)，給予10 g/L卵白蛋白生理鹽水混懸液霧化吸入加以激發(fā)，每次30 s，1次/d，連續(xù)14 d，以腹式呼吸明顯，呼吸頻率加快且節(jié)律不整，活動減少等癥狀為誘喘成功。正常對照組以生理鹽水代替卵白蛋白生理鹽水，其致敏及誘喘時間同造模組。
13治療方法于哮喘發(fā)作次日開始治療：地塞米松組采用腹腔注射地塞米松05 mg/kg，隔天治療1次，共治療7次。經(jīng)皮給藥藥貼組進(jìn)行穴位貼敷治療，穴位選擇：大椎穴、肺俞穴(雙)、腎俞穴(雙)[7]。具體方法：將豚鼠頸背部穴位處用寵物電剪刀剪毛，剪毛范圍：縱向大椎至腎俞，橫向脊柱兩側(cè)各旁開15 cm，用大塊膠布將藥物敷貼固定于穴位處。每次敷藥6 h，治療時間與次數(shù)同地塞米松組。模型組造模成功后令其自然恢復(fù)，正常對照組不給予任何干預(yù)治療。
14樣本制備在末次誘喘后2～4 h內(nèi)，給豚鼠稱體質(zhì)量，用30 g/L戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，迅速斷頭取血，每只取5 mL，室溫放置2 h后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，放冰箱-20 ℃保存待測。同時迅速打開胸腔，暴露肺及心臟，常規(guī)取支氣管肺組織，避免鉗夾組織引起組織受壓影響觀察，取材部位：右中下肺取一橫切面，包括肺門。所取組織經(jīng)100 g/L多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋和切片(厚4 μm)待測。
15檢測方法采用ELISA法定量檢測各組豚鼠血清中COX2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明的方法和要求操作。采用光鏡觀察各組經(jīng)蘇木素—伊紅(HE)染色切片的支氣管肺組織形態(tài)變化。
16統(tǒng)計學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均在SPSS 130上建立數(shù)據(jù)庫、進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與統(tǒng)計分析。各組間差異采用單向方差分析(OneWay ANOVA)，方差齊用LSD檢驗(yàn)，方差不齊用Tamhanes檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=005。
2結(jié)果
21動物數(shù)量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，共剩豚鼠30只，每組隨機(jī)取6只，共24只納入結(jié)果分析。
22各組豚鼠血清COX2水平比較表1結(jié)果顯示：模型組豚鼠血清COX2水平顯著高于正常對照組(P<005)，經(jīng)皮給藥藥貼組、地塞米松組血清COX2水平顯著低于模型組(P<005)醫(yī).學(xué).全.在.線m.payment-defi.com。
23各組支氣管肺組織形態(tài)觀察結(jié)果正常對照組支氣管黏膜上皮完整，平滑肌無明顯的增厚，肺泡壁清晰完整，間隔形態(tài)正常，無明顯的炎癥細(xì)胞表1各組豚鼠血清COX2水平比較(x±s)浸潤。模型組支氣管管壁黏膜上皮細(xì)胞受損和脫落明顯，氣道壁不完整，黏膜下層炎癥明顯，氣道平滑肌增厚，膠原纖維增加，管腔狹窄，氣道腔內(nèi)黏液分泌增多，黏液栓堵塞，氣道周圍嗜酸性粒細(xì)胞明顯增加，肺泡內(nèi)可見彌漫性慢性炎細(xì)胞浸潤、管腔變窄，肺泡基本上實(shí)變，充滿炎癥細(xì)胞，有肺大泡形成，肺泡間隔有明顯充血。地塞米松組支氣管黏膜上皮基本完整，管壁平滑肌層有輕度的增厚，間質(zhì)炎癥細(xì)胞較少，肺泡間隔基本完整，腔內(nèi)有少量的炎癥細(xì)胞，肺泡間隙輕度充血以及有少數(shù)的炎癥細(xì)胞浸潤。經(jīng)皮給藥藥貼組支氣管的黏膜上皮基本完整，平滑肌層有輕度的增厚，管周有少量的炎癥細(xì)胞，肺泡完整，間質(zhì)輕度充血，結(jié)果見圖1(彩圖見第317頁)。
3討論
支氣管哮喘(哮喘)是當(dāng)今世界最常見的慢性疾病，其病理生理改變以氣道慢性非特異性炎癥、氣道反應(yīng)性增高及氣道重建為主要特征，三者相互作用、互相影響 [8] 。
哮喘的治療目前國內(nèi)外首選消除非特異炎癥的糖皮質(zhì)激素，但由于副作用大、成癮性強(qiáng)及易反復(fù)發(fā)作等缺點(diǎn)的存在，使其有效應(yīng)用受到一定限制。穴位敷貼治療哮喘則是在傳統(tǒng)中醫(yī)針灸理論指導(dǎo)下發(fā)揮其獨(dú)特療效的 [9] 。 穴位敷貼給藥為一古老的中醫(yī)外治法，具有不經(jīng)消化系統(tǒng)破壞和肝臟分解，維持較長時間且穩(wěn)定的血藥濃度，從而使藥物作用時間長而穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。而且由于穴位給藥，藥物成分通過經(jīng)絡(luò)感傳影響多層次的生理功能，它們之間可能產(chǎn)生相互激發(fā)和協(xié)調(diào)作用，導(dǎo)致生理上的放大效應(yīng)，使藥物的外治效果可能優(yōu)于內(nèi)服 [10-11] 。本實(shí)驗(yàn)光鏡觀察到的結(jié)果從病理角度驗(yàn)證了穴位貼敷經(jīng)皮給藥藥貼治療豚鼠哮喘的有效性。
哮喘的本質(zhì)是炎性反應(yīng)，來自體液直接反映炎癥存在情況的細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)成為近年來的研究重點(diǎn)，如炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵作用的COX2，已被視為快速炎癥反應(yīng)的重要標(biāo)志之一 [12] 。 COX2主要存在于氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，生理狀態(tài)下它幾乎不被表達(dá)，只有在炎性細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)將細(xì)胞激活的情況下才被表達(dá)[13]。哮喘患者氣道黏膜中有大量的單核—巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤，被激活后可產(chǎn)生大量的COX2，COX2是一種炎性酶，它的表達(dá)可誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)，如前列腺素E2(PGE2)、白細(xì)胞介素6(IL6)、IL8、IL18等，這些炎癥介質(zhì)又加重了炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)哮喘或使哮喘加重，而且COX2的過度表達(dá)與氣道重塑和氣道氣流阻塞程度加重有關(guān) [14-17] 。
