醫(yī)學免費論文:NF�拨蔅及其相關炎性因子致大鼠移植肝冷保存損傷的機制

凝膠電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assays, EMSA)按YANG等[8]的方法提取肝組織的核蛋白，-70℃凍存?zhèn)溆�，用考馬斯亮藍蛋白濃度檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所產品)測定蛋白濃度。結合NF�拨蔅的寡核苷酸探針(上海生工生物工程技術有限公司合成)雙鏈核苷酸序列為5′�睞GT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C��3′，3′�睺CA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G��5′，以γ��32P�睞TP(北京福瑞生物工程公司產品)進行探針標記。室溫下將2μL 5×凝膠滯留結合緩沖液、核蛋白10μg、鮭精DNA(4g/L)1μL混勻，10min后加入γ��32P�睞TP標記的NF�拨蔅探針2μL，反應30min后加入5×上樣緩沖液2μL，60g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳2h(110V)后，-70℃放射自顯影6h。X光片置于BIO�睷AD凝膠圖象分析系統(tǒng)測定NF�拨蔅活性值(A值)來表示提取物中NF�拨蔅的DNA結合活性。NF�拨蔅活性值(A)=滯后帶吸光度值(A)×滯后帶面積值(S)。

1.3.2 冷保存期肝組織TNF�拨梁虸L��1β的測定

采用免疫組化SABC法在石蠟切片上測定TNF�拨梁虸L��1β的表達。TNF�拨梁虸L��1β主要定位于細胞質內，表現(xiàn)為胞質黃染或棕黃色顆粒。免疫組化染色結果判定參照MATTERN的方法[9]。陽性染色深度：未見染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3;陽性細胞百分比：未見染色為0，染色細胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3。將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達，>2分(3～6)判為陽性表達。每組10例標本，每例標本隨機選擇10個高倍視野，記數(shù)100個細胞判定此例標本的表達為陽性或陰性，并計算陽性表達率。

1.3.3 TUNEL法檢測肝細胞凋亡

肝組織石蠟切片厚4μm，采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測。按DeadEndTM TUNEL檢測試劑盒(Promage, USA)操作說明進行操作。陽性細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色著色。每張切片光鏡(20×15)觀察10×500個細胞，計算每100個細胞中平均陽性細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)(apoptosis index, AI)。

1.3.4 再灌注后血清TNF�拨�、IL��1β的測定

血清TNF�拨�、IL��1β采用雙抗體夾心ELISA法，試劑盒購自晶美生物工程公司，采用德國FLUO star OPTIMA高通量微板測試系統(tǒng)測定。

1.3.5 再灌注后血清ALT、AST的檢測

采用日立生化分析儀7160，進行血清ALT、AST的檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。各組樣本間均數(shù)用單因素方差分析比較，各組間陽性率用四格表的確切概率法比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠肝移植模型的制備情況

正式實驗共進行大鼠肝移植手術30例，手術死亡3例，成功率90%。供體手術(18.6±5.2)min，供肝修整(8.5±3)min;受體手術(30.2±6.4)min，無肝期(15.5±3.3)min。門靜脈開放后，肝臟顏色迅速變紅，并可以看到少量金黃色膽汁分泌。3h時存活受體大鼠可自行活動、飲水，滿足獲取標本需要。

2.2 肝組織冷缺血期和再灌注期NF�拨蔅的測定結果

NF�拨蔅在B組和C組冷保存期均呈現(xiàn)不同程度活化，組間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。D組同其他冷保存組相比，NF�拨蔅活性顯著增高(P<0.05)。再灌注后，B組、C組和D組NF�拨蔅活性均較假手術組活性水平增高(P<0.05)。隨著冷保存時間的延長，NF�拨蔅活性增高(P<0.05，表1、圖1)。表1 不同冷保存時間組移植肝NF�拨蔅的活性(略)

2.3 冷保存期肝組織TNF�拨�、IL��1β的測定結果

隨著冷保存時間的延長，TNF�拨梁虸L��1β在肝組織中的陽性表達率逐漸升高，D組TNF�拨梁虸L��1β的陽性表達率較A、B、C組明顯升高(P<0.05，表2)。表2 不同冷保存時間肝組織TNF�拨良癐L��1β的表達(略)

2.4 再灌注期血清TNF�拨�、IL��1β及ALT、AST的測定結果醫(yī).學.全.在.線m.payment-defi.com

再灌注后，B、C、D組TNF�拨梁虸L��1β均較假手術組明顯升高(P<0.05)，而且隨著冷保存時間延長，兩種細胞因子活性均升高(P<0.05)。隨著冷保存時間的延長，再灌注后血清轉氨酶水平升高，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。表3 再灌注后血清TNF�拨�、IL��1β、ALT、AST水平和細胞凋亡指數(shù)(AI)的變化(略)

2.5 再灌注后肝細胞的凋亡情況

凋亡細胞在TUNEL染色中顯示為棕色或褐色小點。A組為正常肝組織，凋亡細胞罕見;隨著冷保存時間的延長，移植肝再灌注后凋亡細胞在B、C、D組中表達逐漸增多，在中央靜脈周圍分布較多。經統(tǒng)計后得出：隨著冷保存時間的延長AI值逐漸升高，B、C 、D組AI值均較A組明顯升高(P<0.05)，而且組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3、圖2)。

3 討 論

NF�拨蔅是一類能與多種基因的啟動子或增強子κB位點發(fā)生特異性結合并啟動基因轉錄的蛋白質。胞質中的NF�拨蔅/I�拨蔅三聚體，可被TNF�拨�、IL��1β、活性氧等多種細胞外刺激信號激活，繼而NF�拨蔅活化入核，與靶基因特異性序列結合并啟動轉錄。轉錄產物包括黏附分子、趨化因子和細胞因子(TNF�拨�、IL��1β)等，這些炎性介質參與P/RI的病理過程[10]。

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