醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:pET15b�瞃ARA�睧GFP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白YARA�睧GFP的表達(dá)與純化

醫(yī)學(xué)免費(fèi)論文:pET15b�瞃ARA�睧GFP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白YARA�睧GFP的表達(dá)與純化

【摘要】 目的：構(gòu)建原核表達(dá)載體pET15b�瞃ARA�睧GFP，并進(jìn)行YARA�睧GFP融合蛋白的表達(dá)和純化。方法：用分子克隆技術(shù)構(gòu)建出表達(dá)型載體pET15b�瞃ARA�睧GFP，在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)融合蛋白YARA�睧GFP，并進(jìn)行Ni2+�睳TA樹(shù)脂柱親和層析以純化蛋白。結(jié)果：經(jīng)測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了表達(dá)型載體pET15b�瞃ARA�睧GFP，YARA�睧GFP融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表達(dá)，純化后的蛋白濃度為1.098 mg/mL。SDS�睵AGE和Western blot分析表明純化蛋白為目的蛋白YARA�睧GFP。結(jié)論：已成功制備出YARA�睧GFP融合蛋白。

【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞穿透肽 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 原核表達(dá) 融合蛋白

Construction of Prokaryotic Expression Plasmid pET15b�瞃ARA�睧GFP and Expression and Purification of YARA�睧GFP Fusion Protein CHEN Si�瞫i1,2,WANG Jia�瞡ing2^,HUANG Yong�瞶hang2,GUO Ling�瞴un2,ZHENG Fei2 (1Cardiovascular Research Institute，Renmin Hospital,Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060;2Institute of Clinical Medicine,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000,China)

Abstract:Objective To construct the expression vector pET15b�瞃ARA�睧GFP and express and purify the fusion protein YARA�睧GFP.Methods Two oligonucleotides encoding YARA were synthesized and annealed to generate YARA�瞖ncoding DNA. The recombinant plasmid pET15b�瞃ARA�睧GFP was constructed by inserting YARA�瞖ncoding DNA into pET15b�睧GFP. The fusion protein YARA�睧GFP induced with IPTG in E.coli BL21(DE3)was purified with Ni2+�瞨esin affinity chromatography and confirmed with SDS�睵AGE and western blot.Results Sequence analysis confirmed successful construction of the expression vector pET15b�瞃ARA�睧GFP,the fusion protein YARA�睧GFP was expressed and purified and its concentration was 1.098 mg/mL.SDS�睵AGE and Western blot demonstrated the fusion protein was YARA�睧GFP.Conclusion YARA�睧GFP fusion protein is successfully prepared醫(yī).學(xué).全.在.線m.payment-defi.com.

Key words:Cell penetrating peptides;Enhanced green fluorescent protein;Prokaryotic expression;Fusion protein

自人類基因組計(jì)劃的完成和蛋白組計(jì)劃的實(shí)施以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)了許多生物大分子具有潛在的治療價(jià)值。但細(xì)胞膜是脂質(zhì)雙分子層，具有選擇通透性，這種天然屏障作用在保護(hù)細(xì)胞的同時(shí)也限制了生物大分子自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。傳統(tǒng)的將大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的常用方法有電穿孔、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等，這些方法不但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，而且對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞均有毒副作用，且僅適用于體外實(shí)驗(yàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)區(qū)域具有將外源性蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的特性，這些區(qū)域被稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞穿透肽[1]，它能攜帶有治療作用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，這使它有可能成為一種理想的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。目前研究最為深入的是來(lái)源于人類免疫缺陷病毒反式激活因子的TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其氨基酸序列為YGRKKRRQRRR。Choi領(lǐng)導(dǎo)的研究小組[2-8]已經(jīng)證實(shí)了TAT�睪FP、TAT�睪DH、TAT�睸OD和TAT�睠AT等融合蛋白能轉(zhuǎn)導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)和皮膚組織。為了進(jìn)一步提高細(xì)胞穿透肽的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，Ho等[9]將TAT的氨基酸序列進(jìn)行優(yōu)化，合成了一種新的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域即YARA，其氨基酸序列為YARAAARQARA，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為T(mén)AT的33倍。為了探討YARA介導(dǎo)的融合蛋白的離體和在體轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，本研究設(shè)計(jì)合成了編碼YARA的DNA序列，通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET15b�瞃ARA�睧GFP，表達(dá)并純化出YARA�睧GFP融合蛋白，為YARA介導(dǎo)的生物大分子EGFP穿透細(xì)胞能力的研究奠定了基礎(chǔ)。

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