公開(公告)號
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CN1304561C
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公開(公告)日
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2007.03.14
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申請(專利)號
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CN200410081264.0
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申請日期
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2004.11.13
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專利名稱
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一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法
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主分類號
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C12N1/14(2006.01)I
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分類號
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C12N1/14(2006.01)I;C12P17/02(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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西南師范大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計)人
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談 鋒;胡 凱;祝順琴;唐克軒;廖志華
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地址
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400715重慶市北碚區(qū)西南師范大學(xué)
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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重慶華科專利事務(wù)所
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代理人
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康海燕
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國省代碼
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重慶;85
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主權(quán)項
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一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法,其特征在于:將莖葉核菌屬的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌(Ectostroma sp.Fr.)XT5與束絲菌屬的產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III的內(nèi)生真菌(Ozonium sp.Lk.exFr.)XT1的培養(yǎng)物進行混合培養(yǎng),提高發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)率,步驟如下: (1)培養(yǎng)基制備 ①PDA培養(yǎng)基: ②發(fā)酵培養(yǎng)基: 葡萄糖2-10g/L 蔗糖10-20g/L 蛋白胨0.5-2.5g/L 醋酸鈉0.5-3g/L MgSO42-5mg/L Ca(NO3)25-100mg/L CuSO40.5-300mg/L ZnSO40.5-200mg/L MnCl21-25mg/L FeCl30.5-10mg/L KH2PO410-350mg/L 維生素B10.5-10mg/L 維生素B60.5-30mg/L 苯丙氨酸0.5-5mg/L 苯甲酸鈉50-1000mg/L 乙酰水楊酸鈉0.01-5mg/L 甲醇5-20ml/L 油酸1-10ml/L,pH 6.8; (2)菌體預(yù)培養(yǎng);分別挑取束絲菌屬的產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III的內(nèi)生真菌XT1和莖葉核菌屬的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌XT5的菌絲接種于含50ml PDA培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中,培養(yǎng)形成種子發(fā)酵液; (3)菌體生長培養(yǎng):分別將上述兩種真菌的種子發(fā)酵液接種于含500ml發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中,培養(yǎng)得到含菌體和培養(yǎng)液的真菌菌液; (4)將上述兩種發(fā)酵物,即真菌菌液進行混合培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇:將生長好的XT5菌液與XT1菌液按1∶0.5~4.0的體積份數(shù)比混合,補加總體積的0.5-1.0倍的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng); (5)紫杉醇提取:將上述發(fā)酵物4000rpm離心15min,上清液和低溫凍溶的菌體加等體積的乙酸乙酯超聲波萃取1h,重復(fù)提取2次;合并所有乙酸乙酯層,于50℃旋轉(zhuǎn)蒸干,甲醇洗滌,加入二氯甲烷和水1∶1v/v萃取后,將二氯甲烷蒸干,準(zhǔn)確量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇樣品; (6)含量檢測:紫杉醇樣品過濾后上高效液相色譜柱,于228nm做定性及定量檢測。
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摘要
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一種提高紅豆杉內(nèi)生真菌發(fā)酵物中紫杉醇產(chǎn)率的方法,本方法利用產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III分別單獨培養(yǎng),然后將培養(yǎng)物進行混合培養(yǎng),并適當(dāng)補加培養(yǎng)基,大幅度提高發(fā)酵物中紫杉醇的產(chǎn)率。本方法的優(yōu)點在于利用兩種同類真菌代謝途徑互補大幅提高發(fā)酵物中紫杉醇的含量,大大高于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌單獨培養(yǎng)的產(chǎn)率水平。使利用內(nèi)生真菌進行工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇成為可能。本方法不但適用于產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與產(chǎn)紫杉醇合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng),提高培養(yǎng)物中紫杉醇含量。也適宜于產(chǎn)生天然有用成分的內(nèi)生真菌與產(chǎn)生天然有用成分合成前體的內(nèi)生真菌混合培養(yǎng),提高培養(yǎng)物中天然有用成分的含量。
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國際公布
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