| 公開(公告)號 | CN1648246A |
| 公開(公告)日 | 2005.08.03 |
| 申請(專利)號 | CN200410075772.8 |
| 申請日期 | 2004.12.30 |
| 專利名稱 | 利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細胞的方法 |
| 主分類號 | C12N15/05 |
| 分類號 | C12N15/05;C12N5/14;A01H4/00 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 山東大學 |
| 發(fā)明(設計)人 | 向鳳寧;夏光敏;蔡云飛;李子東;江莉 |
| 地址 | 250100山東省濟南市歷下區(qū)山大南路27號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 濟南圣達專利商標事務所 |
| 代理人 | 鄭華清 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項 | 一種利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細胞的方法，步驟由雙親材料來源；受體原生質(zhì)體的游離；射線處理供體原生質(zhì)體；雙親原生質(zhì)體的融合與培養(yǎng)；雜種愈傷組織及再生植株的鑒定；體細胞雜種中目標性狀的檢測組成，其特征在于：①雙親材料的選擇、原生質(zhì)體的游離及UV處理供體；②雙親原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng)；上述雙親材料的選擇是指受體和供體材料的選擇，受體材料為柴胡、胡蘿卜、馬鈴薯，供體材料為川西獐牙菜、四數(shù)獐牙菜麥、管花秦艽、白花假龍膽、濕生扁蕾，取上述供體的幼葉及未成熟種子在MS誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織，愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上繼代后，選取胚性愈傷組織作為供體；受體原生質(zhì)體的游離方法是指取繼代培養(yǎng)2～4天的上述受體懸浮培養(yǎng)物，放入酶液中，于25℃下游離3～4小時溫育后用300～400目不銹鋼網(wǎng)過濾，500r/min離心收集原生質(zhì)體，然后用洗液洗一次后，將密度調(diào)至1×106/ml作供體，備用；供體原生質(zhì)體的游離方法同受體；UV照射供體是指將收集的供體原生質(zhì)體用洗液洗一次后，調(diào)成1×106/mL的密度鋪在直徑3.5cm的玻璃培養(yǎng)皿中成薄層后用UV照射；紫外線照射強度為260～380μW/cm2/30s～5min；上述雙親原生質(zhì)體的融合及培養(yǎng)是指將各供體分別與上述受體以1×106/ml的密度按1∶1的體積比混合均勻，用PEG法誘導融合；融合流程如下：(1)原生質(zhì)體滴加在直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中，鋪成一薄層，靜置15分鐘～20分鐘；(2)沿薄層邊緣滴加PEG溶液，靜置15～20分鐘，(3)再加二倍體積的0.225M～0.275MCa(NO3)2液，靜置10分鐘～15分鐘；重復一次；(4)吸掉培養(yǎng)皿中液體，洗液洗兩次，每次5分鐘～10分鐘；(5)用P5液體培養(yǎng)基洗一次；(6)用Parafilm封口，25℃避光保濕培養(yǎng)；再生愈傷組織長至1.5mm～2mm時挑出，轉(zhuǎn)至MS1培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，每天光照12h，光強2000Lux，溫度25℃；其中，上述所用溶液配方為：酶液成分：15mg/mlCellulaseOnozukaRS，3mg/mlPectolyaseY-23，5mMMES，0.6M甘露醇，5mMCaCl2，pH5.8；洗液成分：0.6M甘露醇，5mMCaCl3，pH5.8；PEG溶液的配方：2g葡萄糖，1.5gCa(NO3)2，40g分子量6000的PEG，溶解在100ml無離子水中，調(diào)pH至7.0，抽濾滅菌；Ca(NO3)2溶液的配方：9g無水Ca(NO3)2+200ml無離子水，調(diào)pH至7.0，抽濾滅菌；P5培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基的大量元素+MS培養(yǎng)基的微量元素+B5維生素+500mg/L水解酪蛋白+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+90g/L葡萄糖+975mg/LMES，pH5.6--5.8；MS培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基的大量元素+MS培養(yǎng)基的微量元素+MS維生素+2mg/L甘氨酸+146mg/L谷氨酰氨+30mg/L水解酪蛋白+30mg/L+7g/l蔗糖瓊脂粉，pH5.8--6.0；MS誘導培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2mg/L2，4-D；MS繼代培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+2mg/L2，4-D+0.5mg/L激動素；MS1培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基+1mg/L2，4-D。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開一種利用體細胞雜交技術將藏藥材藥效成分轉(zhuǎn)入受體細胞的方法，主要步驟包括：1)、雙親材料的基因型選擇；2)、受體原生質(zhì)體的游離；3)、UV照射供體原生質(zhì)體；4)供、受體原生質(zhì)體的融合與培養(yǎng)；5)雜種愈傷組織及再生植株的鑒定；6)體細胞雜種中目標性狀的檢測。本發(fā)明是利用體細胞雜交技術獲得藥效成分含量高、生長快速的細胞系，其優(yōu)勢在于：可為資源匱乏、難以培養(yǎng)的名貴藏藥材有效成分生產(chǎn)提供直接而簡便的方法，獲得的藥效成分含量高、生長快速、遺傳穩(wěn)定的雜種細胞系可用于藏藥材藥效成分的工業(yè)化生產(chǎn)，因而在藏藥材資源的有效、快速利用上具有重要的作用，將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。 |
| 國際公布 |
