重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備
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公開(公告)號
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CN1465596A
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公開(公告)日
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2004.01.07
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申請(專利)號
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CN02120969.3
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申請日期
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2002.06.06
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專利名稱
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重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備
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主分類號
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C07K16/18
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分類號
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C07K16/18
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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北京市創(chuàng)傷骨科研究所
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發(fā)明(設(shè)計)人
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趙丹慧;張艷;李成文;袁越
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地址
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100035 北京市新街口東街31號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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代理人
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國省代碼
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北京;11
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主權(quán)項(xiàng)
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一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備，其特征在于：建立兩種微量免疫方法免疫家兔，進(jìn)行rhBMP2抗原不同免疫方式(弗氏不完全佐劑及水劑的給藥次數(shù)不同)的抗原劑量與抗血清效價間的比較研究，獲得高效價的抗體，再采用鹽析、離子交換劑及去載體蛋白等步驟將rhBMP2抗血清制備成rhBMP2 IgG抗體。包括以下步驟；(1)rhBMP2-BSA復(fù)合物的制備(采用戊二醛法)：將高純度的rhBMP2與載體蛋白BSA(牛血清白蛋白)通過雙功能試劑(戊二醛)交聯(lián)，連接成rhBMP2-BSA復(fù)合物。方法：稱rhBMP2 5mg，BSA 8.5mg，用6M的鹽酸胍將rhBMP2溶解，再加入pH7.2，0.01M的PBS至6ml，將BSA加入上述抗原液中，攪拌狀態(tài)下緩慢加入0.2％的戊二醛1.5ml，冰浴60分鐘，再緩慢加入1.9ml 1M的甘氨酸冰浴60分鐘，放入pH7.2，0.01M PBS透析過夜，得到rhBMP2-BSA復(fù)合物。(2)建立免疫方案并免疫動物：首先對實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行四次單一免疫，每次都是將rhBMP2-BSA與弗氏完全佐劑混合制成乳化劑，注入兔的四足掌、背部皮下6點(diǎn)及大腿。從1到4次每只家兔獲得rhBMP2依次為0.223mg----0.198mg。每次免疫持續(xù)時間21天。然后再對實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行兩次分組對比免疫：第1組，將rhBMP2-BSA與弗氏不完全佐劑混合制成乳化劑，注入1號家兔的頸部背部皮下共8點(diǎn)及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續(xù)時間21天。第2組，將rhBMP2-BSA與生理鹽水混合制成水劑，注入2號家兔的頸部背部皮下共8點(diǎn)及大腿。家兔均獲得rhBMP2為0.198mg。每次免疫持續(xù)時間7天。(3)抗血清效價的測定：自初次免疫后第9周起，每周測定抗血清效價，直至處死動物測最后的效價。方法則采用間接ELISA法。(4)rhBMP2抗體的制備：首先用免疫吸收法沉淀載體BSA抗體，每毫升血清加入BSA 5mg，混均后放4℃過夜。次日離心，可見有少量白色沉淀，棄去。將抗血清用50％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃過夜，離心棄上清(rhBMP2抗體)，用pH7.2，0.01M的PBS溶解。再用33％的飽和硫酸鹽析沉淀IgG，放4℃ 60分鐘，離心棄上清，用pH7.2，0.01M的PBS溶解，重復(fù)3次。離心棄上清，對pH7.2，0.01M的PBS透析過夜。離心棄沉淀。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2微量免疫法的建立及抗體的制備，通過建立兩種微量免疫方法免疫家兔，進(jìn)行rhBMP2抗原不同免疫方式的抗原劑量與抗血清效價間的比較研究，再用鹽析、離子交換劑及去載體蛋白等步驟將rhBMP2抗血清制備成rhBMP2 IgG抗體。本發(fā)明可獲得高效價、特異的抗體并比常規(guī)免疫法節(jié)省抗原12.37倍。對骨科的臨床研究有廣泛的應(yīng)用價值并可用于相關(guān)疾病的基礎(chǔ)研究。醫(yī)院及科研機(jī)構(gòu)可應(yīng)用此抗體作為基礎(chǔ)試劑，研制各類標(biāo)記抗體，開發(fā)免疫組化試劑盒。
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國際公布
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