| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1128880C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2003.11.26 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN00124699.2 |
| 申請(qǐng)日期 | 2000.09.29 |
| 專利名稱 | 藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及其用于表達(dá)胸腺素α1的方法 |
| 主分類號(hào) | C12N15/63 |
| 分類號(hào) | C12N15/63;C12N15/67;C12N15/31;C12N15/12;C12N1/13;A61K38/16 |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 廈門大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 章軍;徐虹;秦燕;樓士林;黃瀾;李根 |
| 地址 | 361005福建省廈門市思明南路422號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 陳永秀;馬應(yīng)森 |
| 國(guó)省代碼 | 福建;35 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 熱休克誘導(dǎo)外源基因高效表達(dá)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于根據(jù)藍(lán)藻Synechococcus sp.PCC7942的groESL操縱子中ATG上游240bp片段兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1、P2：P1 5′端引物：5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacIP2 3′端引物：5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphIP2的5′端設(shè)計(jì)了一個(gè)SphI酶切位點(diǎn)，其切點(diǎn)為GCATG↓C；以藍(lán)藻Synechococcus sp.PCC7942基因組DNA為模板，以p1和p2引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增得含groESL啟動(dòng)區(qū)的PCR擴(kuò)增片段；用HindIII酶切質(zhì)粒pKYLX-71-35S，電泳回收4.9kb片段，與經(jīng)同樣酶切的pUC19連接重組，連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101，以氨卞青霉素和卡那霉素篩選得重組質(zhì)粒pUCMT1’；根據(jù)胸腺素α1基因片段兩端的序列設(shè)計(jì)PCR引物T1、T2和T2’：T1 5′端引物：5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphI BamHIGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2 3′端引物：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalI SpeIACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’3′端引物：5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalI SpeI以常規(guī)PCR擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增后得110bp的Tα1 DNA片段；運(yùn)用pUC18多克隆位點(diǎn)兩端的通用引物U1和U2：U1 5′端引物：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2 3′端引物：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以質(zhì)粒pUCUB為模板，按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出含UB基因的328bp的DNA片段：純化UBDNA片段和Tα1 DNA片段，用BamHI同時(shí)酶切，然后用T4DNA連接酶連接，以連接產(chǎn)物為模板，以U1和T2’為引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得380bp的UBTα1 DNA片段；用SphI同時(shí)單酶切g(shù)roESL啟動(dòng)區(qū)的PCR擴(kuò)增片段和UBTα1 DNA片段，連接后以連接物為模板，P1、T2’為引物按常規(guī)PCR法擴(kuò)增后得ESL-UBTα1片段，將ESL-UBTα1片段插入到質(zhì)粒pUCMT1’的SacI-XbaI位點(diǎn)之間，連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101，在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，獲得包含熱休克基因groESL的強(qiáng)啟動(dòng)區(qū)、目的基因UBTα1，終止區(qū)以及Km標(biāo)記基因的藍(lán)藻的完整表達(dá)載體質(zhì)粒pEUTMT1。 |
| 摘要 | 涉及一種藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)外源基因的方法，構(gòu)建了包含藍(lán)藻熱休克基因groESL強(qiáng)啟動(dòng)區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標(biāo)記基因的完整的可高效表達(dá)的藍(lán)藻基因表達(dá)系統(tǒng)，并運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)和穿梭質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)胸腺素α1，由于利用熱休克基因groESL的強(qiáng)啟動(dòng)子，易調(diào)控，經(jīng)熱誘導(dǎo)后能幾十上百倍地加快轉(zhuǎn)錄，同時(shí)利用泛素融合技術(shù)，使目的基因Tα1得到高效表達(dá)，轉(zhuǎn)化藻的藻株中UBTα1的表達(dá)量分別達(dá)到17.6％和10％，且工藝簡(jiǎn)單、成本低。 |
| 國(guó)際公布 |
