公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN1128880C
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公開(kāi)(公告)日
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2003.11.26
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN00124699.2
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申請(qǐng)日期
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2000.09.29
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專利名稱
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藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及其用于表達(dá)胸腺素α1的方法
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主分類號(hào)
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C12N15/63
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分類號(hào)
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C12N15/63;C12N15/67;C12N15/31;C12N15/12;C12N1/13;A61K38/16
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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廈門大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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章軍;徐虹;秦燕;樓士林;黃瀾;李根
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地址
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361005福建省廈門市思明南路422號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所
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代理人
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陳永秀;馬應(yīng)森
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國(guó)省代碼
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福建;35
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主權(quán)項(xiàng)
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熱休克誘導(dǎo)外源基因高效表達(dá)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng),其特征在于根據(jù)藍(lán)藻Synechococcus sp.PCC7942的groESL操縱子中ATG上游240bp片段兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1、P2:P1 5′端引物:5′-TCGCGAGCTCGACAACTGTC-3′SacIP2 3′端引物:5′-CCGCATGCTTTTGAGTAAACGTCGTCACGG-3′SphIP2的5′端設(shè)計(jì)了一個(gè)SphI酶切位點(diǎn),其切點(diǎn)為GCATG↓C;以藍(lán)藻Synechococcus sp.PCC7942基因組DNA為模板,以p1和p2引物進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增得含groESL啟動(dòng)區(qū)的PCR擴(kuò)增片段;用HindIII酶切質(zhì)粒pKYLX-71-35S,電泳回收4.9kb片段,與經(jīng)同樣酶切的pUC19連接重組,連接物轉(zhuǎn)化E.coli JM101,以氨卞青霉素和卡那霉素篩選得重組質(zhì)粒pUCMT1’;根據(jù)胸腺素α1基因片段兩端的序列設(shè)計(jì)PCR引物T1、T2和T2’:T1 5′端引物:5’-GGGCATGCAAGGATCCGACGCAGCTSphI BamHIGTTGACACCAGCTCCGAAATCACCACCAAAGACTTAAAGG-3’T2 3′端引物:5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTCASalI SpeIACAACTTCTTTTTTTTCCTTTAAGTCTTTGGTGGTGATT-3’T2’3′端引物:5’-GGGTCGACTAGTTTTCTGCTTCTTC-3’SalI SpeI以常規(guī)PCR擴(kuò)增法進(jìn)行擴(kuò)增后得110bp的Tα1 DNA片段;運(yùn)用pUC18多克隆位點(diǎn)兩端的通用引物U1和U2:U1 5′端引物:5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’U2 3′端引物:5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’以質(zhì)粒pUCUB為模板,按常規(guī)PCR方法擴(kuò)增出含UB基因的328bp的DNA片段:純化UBDNA片段和Tα1 DNA片段,用BamHI同時(shí)酶切,然后用T4DNA連接酶連接,以連接產(chǎn)物為模板,以U1和T2’為引物進(jìn)行特異性擴(kuò)增,得380bp的UBTα1 DNA片段;用SphI同時(shí)單酶切g(shù)roESL啟動(dòng)區(qū)的PCR擴(kuò)增片段和UBTα1 DNA片段,連接后以連接物為模板,P1、T2’為引物按常規(guī)PCR法擴(kuò)增后得ESL-UBTα1片段,將ESL-UBTα1片段插入到質(zhì)粒pUCMT1’的SacI-XbaI位點(diǎn)之間,連接物轉(zhuǎn)化受體菌E.coli JM101,在具有Ap與Km的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子,獲得包含熱休克基因groESL的強(qiáng)啟動(dòng)區(qū)、目的基因UBTα1,終止區(qū)以及Km標(biāo)記基因的藍(lán)藻的完整表達(dá)載體質(zhì)粒pEUTMT1。
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摘要
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涉及一種藍(lán)藻轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)外源基因的方法,構(gòu)建了包含藍(lán)藻熱休克基因groESL強(qiáng)啟動(dòng)區(qū)、目的基因UBTα1、rbcS終止區(qū)和Km標(biāo)記基因的完整的可高效表達(dá)的藍(lán)藻基因表達(dá)系統(tǒng),并運(yùn)用基因整合平臺(tái)系統(tǒng)和穿梭質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)胸腺素α1,由于利用熱休克基因groESL的強(qiáng)啟動(dòng)子,易調(diào)控,經(jīng)熱誘導(dǎo)后能幾十上百倍地加快轉(zhuǎn)錄,同時(shí)利用泛素融合技術(shù),使目的基因Tα1得到高效表達(dá),轉(zhuǎn)化藻的藻株中UBTα1的表達(dá)量分別達(dá)到17.6%和10%,且工藝簡(jiǎn)單、成本低。
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國(guó)際公布
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