| 公開(公告)號 | CN1995343A |
| 公開(公告)日 | 2007.07.11 |
| 申請(專利)號 | CN200610168056.3 |
| 申請日期 | 2006.12.25 |
| 專利名稱 | 制備可溶高活性重組納豆激酶的方法 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N9/12(2006.01)I;C12N1/21(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | |
| 申請(專利權)人 | 李慧潔;楊秀桃 |
| 發(fā)明(設計)人 | 李慧潔;楊秀桃 |
| 地址 | 471003河南省洛陽市澗西區(qū)安徽路1號院1棟1門301 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構 | 太原市科瑞達專利代理有限公司 |
| 代理人 | 劉寶賢 |
| 國省代碼 | 河南;41 |
| 主權項 | 一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，其特征在于： 構建含有前導肽序列的納豆激酶基因克隆，加入GST蛋白標簽和PDI的分子伴侶幫助目的基因在大腸桿菌中高效表達，在序列中內嵌入HIS標簽和蛋白酶切位點幫助目的蛋白高效提純，以及生物活性的鑒定，具體方法為： 1)以Bacillus Subtilis Natto菌體為模板，根據(jù)納豆激酶(Nattokinase，簡稱NK)全長序列設計引物，通過PCR的方法獲得包含前導肽的全長納豆激酶基因，稱為proNK；在proNK基因的3′末端增加HIS標簽序列(六個連續(xù)的組氨酸，HIS6)，再將proNK加HIS標簽的基因克隆進入pGEX-6P載體；接著利用PCR將分子伴侶PDI的全長基因克隆出來接到proNK基因的3′末端；在PDI基因的前端加入Prescission Protease(簡稱PPase)蛋白酶切位點序列(序列用pp表示)，這樣組裝成為高效表達載體pGEX-6p-proNK-HIS6-pp-PDI，簡稱6pNHP；相應表達出的重組蛋白為GST-pp-proNK-HIS6-pp-PDI； 2)6pNHP轉化大腸桿菌Rosseta，用IPTG誘導重組基因的表達；同時將含有PPase的質粒轉入Rosseta菌株，一起誘導表達；然后將兩種菌體按比例收集在一起； 3)用含有10％甘油的Tris緩沖液重懸細菌，超聲破碎，離心收集上清液；調整PH值，低溫振蕩使PPase將重組蛋白酶切完全，釋放出proNK蛋白，從而得到高濃度的含有納豆激酶的溶液；進行蛋白定量分析和活性測定； 4)將含有納豆激酶的溶液進行純化處理。 |
| 摘要 | 一種制備可溶高活性重組納豆激酶的方法，特別是涉及納豆激酶表達載體的構建、表達和純化工藝，解決了一般的基因工程重組表達的方法導致納豆激酶以包涵體的形式出現(xiàn)在表達產(chǎn)物當中的問題。本發(fā)明方法包括表達全長的帶有前導肽的納豆激酶基因以提高活性，加入重要的分子伴侶PDI幫助蛋白正確折疊、利用GST標簽提高蛋白可溶性、利用硫酸銨沉淀法快速提純產(chǎn)品、加入HIS蛋白標簽幫助產(chǎn)物進一步純化等等。這樣的納豆激酶產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高，活性高，成本低，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)品質量穩(wěn)定。產(chǎn)物可以制作藥物或者口服保健品，利于向大眾推廣，成為新一代的溶栓產(chǎn)品。 |
| 國際公布 |
