公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN101003816A
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公開(kāi)(公告)日
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2007.07.25
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申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)
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CN200710008445.4
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申請(qǐng)日期
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2007.01.11
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專(zhuān)利名稱(chēng)
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人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
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主分類(lèi)號(hào)
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C12N15/85(2006.01)I
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分類(lèi)號(hào)
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C12N15/85(2006.01)I;C12N15/12(2006.01)I;C12N15/66(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人
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廈門(mén)大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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呂文清
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地址
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361005福建省廈門(mén)市思明南路422號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu)
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廈門(mén)南強(qiáng)之路專(zhuān)利事務(wù)所
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代理人
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陳永秀;馬應(yīng)森
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國(guó)省代碼
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福建;35
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主權(quán)項(xiàng)
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人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法,其特征在于包括以下步驟: 步驟1、pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒的構(gòu)建 (1)以從胎盤(pán)提取的組織總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成PEX cDNA第一條鏈; (2)根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)和載體pGEX-4T-3(AmershamBiosciences公司產(chǎn)品)的多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)PCR引物PEX446S:序列為5’-CTG AAT TCC TCTCCT GAC ATT GAC CTT G-3’,上游引物,帶限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I酶切位點(diǎn);PEX660A:序列為5’-CGC TCG AGA GGA AGG GCC TGT GG-3’,下游引物,帶限制性?xún)?nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn); (3)以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條鏈為模板,利用PCR技術(shù),用上游引物PEX446S和下游引物PEX660A一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1629bp~2304bp片段,即長(zhǎng)度為676bp的PEX cDNA片段,并重組入載體pGEX-4T-3中,得編碼人MMP2從446aa到660aa的PEX片段PEX215; (4)將PEX215重組于GST融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-3,獲得序列正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-3/PEX215; 步驟2、PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2 C端片段PEX cDNA 根據(jù)人MMP2序列(Genbank Accession No.:NM_004530)及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense,其中上游引物PEX466sense,序列為5’-GTG TGG CCC AGC CGG CCC CTG AGA TCT GCA AAC-3’,帶限制性?xún)?nèi)切酶Sfi I酶切位點(diǎn);下游引物PEX660antisense,序列為5’-CGC TCG AGG CAG CCTAGC CAG TC-3’,帶限制性?xún)?nèi)切酶Xho I酶切位點(diǎn);以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板,用引物PEX466sense與PEX660antisense一起擴(kuò)增人MMP2 cDNA 1685bp~2269bp片段,即585bp的PEX cDNA片段,編碼人MMP2從466aa到660aa的PEX蛋白; 步驟3、真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增的PEX cDNA片段和載體pSecTag A經(jīng)Sfi I和XhoI雙酶切后,經(jīng)連接酶連接后構(gòu)建質(zhì)粒pSecTag A/PEX,該質(zhì)粒表達(dá)的PEX蛋白N端帶有Ig κ-鏈前導(dǎo)鏈,C端帶有Myc表位標(biāo)簽,Ig κ-鏈前導(dǎo)肽可介導(dǎo)PEX分泌到胞外,Myc表位檢測(cè)標(biāo)簽可用于外源性PEX蛋白的檢測(cè)以區(qū)別于內(nèi)源性PEX蛋白。
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摘要
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人PEX分泌型真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建方法及其應(yīng)用,涉及一種真核表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)人MMP2序列及其編碼框架以及pSecTag A載體多克隆位點(diǎn),設(shè)計(jì)二條PCR反應(yīng)引物PEX466sense和PEX660antisense,以pGEX-4T-3/PEX215質(zhì)粒為模板,以PCR技術(shù)擴(kuò)增人MMP2C端片段PEXcDNA,再構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pSecTag A/PEX。構(gòu)建方法更加簡(jiǎn)捷,同時(shí)用人PEX cDNA作為插入片段構(gòu)建的真核表達(dá)載體更有利于人PEX細(xì)胞功能研究和相關(guān)應(yīng)用研究。所構(gòu)建的質(zhì)?勺鳛橐环N基因治療藥物用于腫瘤等相關(guān)疾病的治療。
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國(guó)際公布
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