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火雞出血性腸炎(Hemorrhagic Enteritis HE)自Pomeroy和Fenstermacher最先在美國(guó)報(bào)道以來(lái)，已有60多年的歷史，但至今仍是遍及世界火雞養(yǎng)殖地區(qū)的一種急性傳染病。該病是由火雞出血性腸炎病毒引起的，它主要感染四周齡或較老齡的火雞，以火雞沉郁，脾腫大，出血性腸炎，免疫抑制等為典型特征，可經(jīng)口腔或泄殖腔感染，但沒(méi)有經(jīng)卵傳染本病的報(bào)道。自然感染的死亡率隨火雞年齡和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件而不同，由10％到60％，實(shí)驗(yàn)感染的死亡率可高達(dá)80％，給經(jīng)濟(jì)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的損失，據(jù)估計(jì)美國(guó)各州每年因本病造成的損失竟達(dá)3百萬(wàn)美元以上，已引起人們極大的關(guān)注。國(guó)外對(duì)該病的研究比較多，且隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，該病毒在病毒分子學(xué)領(lǐng)域的研究也已取得了較大的進(jìn)展。國(guó)內(nèi)對(duì)該病的研究和報(bào)道還很少見(jiàn)。本文就國(guó)外對(duì)HEV的生物學(xué)特性、基因組結(jié)構(gòu)、病毒編碼蛋
白及其功能等方面研究作一綜述。1 火雞出血性腸炎病毒生物學(xué)特征 火雞出血性腸炎病毒(Hemorrhagi Enteritis Virus，HEV)是引起火雞出血性腸炎的病原體。它連同
雉雞大
理石紋脾病病毒(MSOV)，雞大脾病病毒(ASSV)同屬腺病毒科，禽腺病毒屬1群中的成員。在血清學(xué)方面它們與禽腺病毒I和Ⅲ群成員有嚴(yán)格的區(qū)別。病毒粒子呈二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，為裸露的線形雙股DNA。直徑約為72nm。SureshM等用DNA雜交技術(shù)和PCP,擴(kuò)增技術(shù)研究表明HEV的復(fù)制主要集中在脾臟中的B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，產(chǎn)生大量的IgM，而不能在CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞中繁殖，這點(diǎn)HEV與哺乳動(dòng)物腺病毒完全不同(哺乳動(dòng)物腺病毒能感染T淋巴細(xì)胞并在其中繁殖)。據(jù)RautenschleinS報(bào)道其繁殖的速度與宿主脾臟細(xì)胞凋亡的速度呈正相關(guān)。HEV在感染的細(xì)胞漿中相當(dāng)穩(wěn)定，對(duì)乙醚、氯仿有抵抗力，但在丙酮中不穩(wěn)定，對(duì)酸堿度及溫度的耐受范圍較寬。2 HEV的基因組結(jié)構(gòu) HEV的基因組全長(zhǎng)為26 263bp，是目前已知腺病毒中最短的一個(gè)。其G+C含量為34。93％。在其基因結(jié)構(gòu)中起始密碼為
甲硫氨酸，編碼容量大于100個(gè)
氨基酸的開(kāi)放閱讀框架(ORF)有八個(gè)，編碼50～100個(gè)氨基酸的ORF，上鏈有16個(gè)，下鏈有21個(gè)。 HEV的末端倒置重復(fù)序列(ITR)有39個(gè)堿基對(duì)，這與其它腺病毒相比要短許多。在人腺病毒9～18位堿基對(duì)之間有TTAT保守序列，是病毒復(fù)制的起始點(diǎn)。HEV在該區(qū)域與人腺病毒具有高度的保守性，只是缺失了第12位上的腺嘌呤。末端前體蛋白(PTP)和DNA聚合酶(POL)復(fù)合物在此處與之相連。第19位一39位之間為B區(qū)，含GGGAGG序列，SPl轉(zhuǎn)錄因子可能與該序列相互連接并促進(jìn)病毒DNA復(fù)制的快速有效啟動(dòng)。 腺病毒基因組由早期轉(zhuǎn)錄單位和晚期轉(zhuǎn)錄單位組成。早期轉(zhuǎn)錄單位(E1～E4)與病毒DNA復(fù)制、代謝和調(diào)節(jié)有關(guān)。其中El、E4是病毒生長(zhǎng)必需區(qū)，對(duì)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)化和關(guān)閉宿主蛋白合成起重要作用。HEV的E1區(qū)和E4區(qū)與其它的腺病毒很不相同，它由二簇開(kāi)放閱讀框架構(gòu)成。對(duì)應(yīng)El區(qū)的有ORFl、2、3、4．對(duì)應(yīng)E4區(qū)的有ORF7、8。雞胚致死孤兒病毒(CELO)的El區(qū)與HEV的n區(qū)很相似。從CELO能夠誘導(dǎo)小倉(cāng)鼠形成
腫瘤可以知道，CELO的ORF中分布著El區(qū)的一些編碼基因，在這一方面HEV很可能與之相似。與其它腺病毒相同，HEV的E2基因產(chǎn)物直接涉及病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。其中，E2A區(qū)主要編碼DNA結(jié)合蛋白(DBP)，E2B區(qū)編碼末端前體蛋白(PTP)和DNA多聚酶(POL)。HEV的E3區(qū)是一個(gè)900bp的開(kāi)放閱讀框架。與其它的腺病毒相同，該區(qū)位于HEV的PVI和纖維蛋白之間。在此區(qū)中不同的腺病毒編碼各種大小不同的蛋白產(chǎn)物。由于該區(qū)是腺病毒生長(zhǎng)非必需區(qū)，缺失或取代E3區(qū)的腺病毒在細(xì)胞上仍能生長(zhǎng)，因而人們常在該區(qū)插入外源基因構(gòu)建重組腺病毒。 HEV的晚期轉(zhuǎn)錄單位(L1-L5)與其它腺病毒相同，主要編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白和部分晚期調(diào)節(jié)蛋白，是裝配成成熟病毒粒子所必需的。HEV的RNA轉(zhuǎn)錄物主要起始于晚期啟動(dòng)子(MLP)，根據(jù)剪切方式及終止位點(diǎn)的不同，分成5組，分別為：L1(52k，Ⅲa)、L2(五鄰體，CPl，CP2)、L3 (PVI，六鄰體，內(nèi)肽酶)、L4(100k，33k，P)、L5(纖維蛋白)。 在腺病毒感染期間，也有病毒蛋白的合成，它們主要是PVI和N2中期基因，HEV與其它禽腺病毒一樣無(wú)PVI基因，Ⅳ2基因比其它腺病毒要短，能促進(jìn)主要晚期啟動(dòng)子的表達(dá)。3 病毒蛋白的結(jié)構(gòu)與功能3．1 E1區(qū)編碼蛋白 HEV無(wú)明顯的Ela、Eib區(qū)，HEV在該區(qū)的編碼蛋白可能就分布在ORFs中。這些蛋白與細(xì)胞凋亡有關(guān)。3．2 病毒晚期結(jié)構(gòu)蛋白 對(duì)HEV晚期結(jié)構(gòu)蛋白的研究尚未完全弄清，該文就其中較為清楚的晚期蛋白做一敘述。3．2．1 五鄰體 土2個(gè)五鄰體顆粒分別位于病毒20面體的頂上。五鄰體由基部和由基部向外伸出的纖絲組成。HEV每個(gè)五鄰體有一條纖維突起，這與EDSV不同，EDSV每個(gè)五鄰體有二條纖維。在許多的人腺病毒中，有一個(gè)共同的三肽序列，即Arg／Gly／Asp(RGD)，該序列是病毒與宿主細(xì)胞連接整合的位點(diǎn)，并引起細(xì)胞對(duì)病毒的內(nèi)吞作用。HEV的五鄰體基座上無(wú)RGD序列，因而，HEV可能不是通過(guò)與宿主細(xì)胞上的。V整合進(jìn)宿主的。進(jìn)一步的序列分析揭示五鄰體基座上的Leu-Asp-Va[(LDV)氨基酸序列與人腺病毒是一致的。纖維蛋白上的LDV基元通常與宿主淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的04p1相互連接整合。HEV五鄰體基座上的LDV序列預(yù)示了其可能就是通過(guò)該序列與Q4p1整合進(jìn)宿主細(xì)胞。3．2．2 核心蛋白 JuckerMT等用DNA雜交技術(shù)對(duì)HEV基因作圖譜分析發(fā)現(xiàn)HEV的核心蛋白分別對(duì)應(yīng)于人腺病毒的Pv蛋白、mu蛋白和PVII蛋白，位于六鄰體和PVI之間。核心蛋白1具有豐富的Arg／Pro／tMa．這可能與它在DNA的裝配中充當(dāng)DNA結(jié)合蛋白有關(guān)。3．2．3 PVI HEV的PVI大小與其它的腺病毒的基本相同。在蛋白的兩個(gè)末端具有相同的兩個(gè)切割位點(diǎn)。在PVI N端約30位的I型內(nèi)肽酶切點(diǎn)(L，M，I)XGG'X和位于其C端的II型內(nèi)肽酶切點(diǎn)高度保守，后者的切割將產(chǎn)生長(zhǎng)為11肽的巰基內(nèi)肽酶輔助因子。PVI-11肽中的半
胱氨酸對(duì)二聚體的形成和巰基內(nèi)肽酶的激活是必需的。3．2．4 六鄰體 HEV的六鄰體蛋白大小約100kDa。由于它是構(gòu)成病毒衣殼的主要蛋白，它的大小對(duì)病毒的大小起著決定性的作用。六鄰體與其它的蛋白相連，它的氨基酸序列在決定腺病毒不同型與群表面特異性抗原方面起著非常重要的作用。基于這點(diǎn)，早在1993年，vandenHurk JV等人就用HEV六鄰體制備的單克隆抗體免疫火雞，結(jié)果得到很好的保護(hù)。同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)，用非天然的六鄰體蛋白來(lái)免疫火雞并不能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，從而可以看出六鄰體的天然構(gòu)象對(duì)其免疫的重要性。繼后，CardonaCJ等(2001，1999)[n-12-]將HEV六鄰體基因及構(gòu)成它的100kDa折疊蛋白基因與雞痘病毒進(jìn)行整合并表達(dá)，并用其表達(dá)的產(chǎn)物來(lái)免疫火雞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)含有高滴度的病毒抗體。用此法制備的重組疫苗不僅能夠產(chǎn)生很好的免疫力，且無(wú)常規(guī)疫苗接種后所產(chǎn)生的免疫抑制現(xiàn)象。3．2．5 病毒蛋白酶 與其它腺病毒相比，HEV蛋白酶的C末端比其它的腺病毒多了幾個(gè)氨基酸。不同的腺病毒，其蛋白酶氨基酸序列在一些區(qū)域具有保守性。在人腺病毒的蛋白酶中有三個(gè)氨基酸構(gòu)成酶的活性中心，即His54，Glu71，Cysl22．HEV的活性中心與之相似，只是Asp取代了Glu71。在活性中心以外的區(qū)域也高度保守，這可能在穩(wěn)定活性中心是必需的。該酶是所有腺病毒中最保守的蛋白，它主要切割病毒蛋白的(M，L，1)XGXG和(M，L，1)XGGX位點(diǎn)，對(duì)病毒粒子的成熟和感染力至關(guān)重要。3．2．6 纖維蛋白 HEV的五鄰體基座上只有一個(gè)纖維蛋白，其長(zhǎng)度比其它的腺病毒要短，約有17nm。從其N(xiāo)端至C端依次排列著蛋白纖維三個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，即尾區(qū)，柄區(qū)，頂端球區(qū)。它的作用主要是識(shí)別細(xì)胞上的特異受體，從而使病毒與宿主細(xì)胞特異的結(jié)合。3．3 E2區(qū)蛋白 E2區(qū)主要包括以下幾種蛋白。3．3．1 末端前體蛋白(pTP) I-lEV的pTP有597個(gè)氨基酸，由嚴(yán)形成成熟蛋白須在蛋白的第169和297位點(diǎn)進(jìn)行切割，該切割位點(diǎn)與雞減蛋綜合征病毒(EDSV)接近，為第156和265氨基酸。該蛋白的功能主要是在病毒復(fù)制起始中充當(dāng)引物并促進(jìn)病毒編碼的DNA多聚酶的核定位。3． 3．2 DNA多聚酶(POL) HEV的POL無(wú)論在大小和氨基酸序列方面都與其它腺病毒相似。LPutcovshc：]對(duì)其蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其925-933氨基酸殘基序列與DNA多聚酶B家族相同。3．4 DNA結(jié)合蛋白(DBP) HEV 的DBP位于負(fù)鏈內(nèi)在蛋白與100kb基因之間，大小約345個(gè)氨基酸殘基，比其它的腺病毒要小。它的C末端與其它的腺病毒具有高度的同一性。它與病毒DNA結(jié)合并啟動(dòng)晚期啟動(dòng)子進(jìn)行復(fù)制。此外，在核的定位及轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中也發(fā)揮著重要的作用。3．5 lVaII 是病毒中期表達(dá)蛋白，它對(duì)病毒晚期基因的表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用。3．6 E3區(qū)和E4區(qū) HEV的E3區(qū)編碼的蛋白產(chǎn)物與OAV的E3區(qū)編碼產(chǎn)物具有低相似性。E3區(qū)與E4區(qū)分別編碼具有調(diào)控作用和與宿主細(xì)胞成分緊密相連的蛋白質(zhì)，由于腺病毒具有對(duì)宿主的選擇性，因而在這些區(qū)域所編碼的蛋白也具有選擇性，但作用可能都相似，如E3區(qū)基因產(chǎn)物主要與抵抗宿主免疫作用有關(guān)，E4區(qū)編碼產(chǎn)物主要是促進(jìn)病毒的復(fù)制，增強(qiáng)病毒晚期基因的表達(dá)，并抑制宿主基因的表達(dá)。然而到目前為止，人們還不太清楚其準(zhǔn)確定位。4 HEV與其它腺病毒的關(guān)系 腺病毒的分類(lèi)中有三個(gè)參數(shù)對(duì)其分類(lèi)地位起著關(guān)鍵性的作用，它們分別是反向末端重復(fù)系列(1TR)，G+C百分含量和病毒DNA的長(zhǎng)度。我們已知HEV含有26 263bp，是目前所知道最短的腺病毒。G-PC百分含量為34．93％，比其它禽腺病毒低。EDSV的G+C百分含量為42．5％，CELO為54，3％，人腺病毒百分含量在48％～59之間，羊腺病毒(OAV)的Gq-C百分含量與之接近為33．6％。HEV的ITR含39bp，在人腺病毒中相同的亞屬I(mǎi)TR的大小相似。通過(guò)與其它腺病毒相比發(fā)現(xiàn)，如果按以往腺病毒分類(lèi)情況來(lái)看，HEV無(wú)論從結(jié)構(gòu)基因的大小，ITR長(zhǎng)度還是Gq-C百分含量都與哺乳動(dòng)物腺病毒OAV非常的相近，OAV的長(zhǎng)度為29 544bp，G+C百分含量為33．6％，ITR有46bp。而與禽腺病毒卻相隔較遠(yuǎn)。另外，從它們的基因組結(jié)構(gòu)與序列來(lái)分析比較也發(fā)現(xiàn)，HEV與OAV腺病毒的關(guān)系比較近，這樣的矛盾引發(fā)我們不得不去想，哺乳動(dòng)物腺病毒與禽腺病毒的分類(lèi)是否要作重新的修改。5 HEV分子病毒學(xué)研究的意義與前景 近年來(lái)，隨著對(duì)腺病毒研究的不斷深入，尤其在動(dòng)物腺病毒方面，由于其具有與人腺病毒類(lèi)似的基因組結(jié)構(gòu)，能轉(zhuǎn)染人的細(xì)胞，具備將外源基因轉(zhuǎn)移到人細(xì)胞內(nèi)的能力，卻不能在人細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，有較高的安全性，已引起人們高度的重視。HEV作為禽腺病毒中的一員，從分子病毒學(xué)角度對(duì)其基因組進(jìn)行分析，從而使人們更加清楚其致病機(jī)理，且為尋找保護(hù)性抗原制作活載體疫苗提供理論依據(jù)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有疫苗免疫后出現(xiàn)的抑制現(xiàn)象。又由于HEV除能感染其天然宿主火雞外，還能感染雛雞，因而，它也可以作為雞的活載體，在雞體內(nèi)表達(dá)雞病毒保護(hù)性抗原為構(gòu)建雞疫苗提供新的思路。總之，這所有的一切都有待于人們對(duì)HEV基因組的進(jìn)一步了解，以獲得更大片段的非必需區(qū)供外源基因插入，為多價(jià)基因工程活載體疫苗的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，同時(shí)HEV基因組的結(jié)構(gòu)與功能的探索，又為基因治療提供清晰的分子生物學(xué)背景。相信在不久的將來(lái)，HEV分子病毒學(xué)研究必將會(huì)有新的突破和廣泛應(yīng)用。
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