豬瘟,豬繁殖與呼吸綜合征豬圓環(huán)病毒2型混合感染
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2005年底江蘇某豬場(chǎng)飼養(yǎng)的商品肉豬群中部分豬只陸續(xù)發(fā)生高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸困難等癥狀，病程一般持續(xù)5～7天，發(fā)病豬一般以死亡為轉(zhuǎn)歸，發(fā)病豬在瀕死前發(fā)生全身
抽搐等神經(jīng)癥狀。不同年齡段的豬群中均有不同程度的發(fā)生，臨床表現(xiàn)基本相似。通過臨床病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合的方法，診斷為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征，豬圓環(huán)病毒2型混合感染。1 材料與方法 1.1 細(xì)菌培養(yǎng)基 巧克力培養(yǎng)基、綿
羊血平板均按常規(guī)方法制備。1.2 熒光抗體 FITC標(biāo)記的豬瘟熒光抗體購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。1.3 PCR引物 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)特異的PCR引物參照Gilbert等的方法合成，引物序列為：PRRSVF：5′CCTCCTGTATGAACTTGA3′；PRRSVF：5′AGGTCCTCGAACTTGAGCTG3′。豬圓環(huán)病毒2型（Porcing circovirus type 2，PCV2)特異的PCR引物參照Larochelle等的方法合成，引物序列為：PRRSVF：5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′；PRRSVF：5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′�！糑G-6〗所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.4 分子生物學(xué)試劑 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司；dNTP、RNAsin、Taq DNA聚合酶、等購自大連TaKaRa公司；Trizol購自上海生工生物工程有限公司；100bp DNA 梯度Marker購自MBI公司。1.5 病料采集 對(duì)部分發(fā)病比較嚴(yán)重的或剛剛死亡的豬進(jìn)行仔細(xì)剖檢，分別采集鼻腔分泌物、
心包液、心血、心、肝、脾、肺、腎等病料，供實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用。1.6 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn) 將采集的鼻腔分泌物、心血、
心包積液分別涂片，革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡檢查。同時(shí)將心血和心包積液接種
綿羊血平板和巧克力瓊脂，37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。1.7 豬瘟抗原檢測(cè) 采用間接免疫熒光試驗(yàn)法，取病、死豬的扁
桃體、淋巴結(jié)、脾進(jìn)行組織觸片，自然干燥后用冷丙酮-20℃固定20 min，再用PBS（pH7.2)洗滌3次，每次5 min，滴加豬瘟熒光抗體，37℃濕盒作用30 min，用PBS洗滌3次，每次5 min，干后滴加
甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡檢查。1.8 PRRSV和PCV2的PCR檢測(cè)1.8.1 核酸提取 病料RNA和DNA用Trizol試劑提取，按照說明書提供的方法進(jìn)行。首先將病料剪碎，用研磨器勻漿后制成1∶10懸液，取100 μl樣品加入1 ml Trizol試劑，混勻后室溫作用5 min，加入200 μl氯仿，振蕩混勻后室溫作用5 min，12 000 r/min離心5 min，將上清移入新的滅菌指形管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置5 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%
乙醇洗滌沉淀兩次，室溫吹干，用30 μl DEPC處理的滅菌超純水溶解沉淀。一半用PRRSVR引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，另一半直接用作PCV2的PCR檢測(cè)。1.8.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄體系為25 μl，其中含5×MMLV緩沖液5 μl，RNA 12.5 μl，2.5 mmol dNTP 5 μl，PRRSVR引物1 μl，RNAsin 0.5 μl，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl�；靹蚝螅�37℃作用1 h，95℃作用5 min滅活MMLV反轉(zhuǎn)錄酶。1.8.3 PCR試驗(yàn) PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中含10×Taq DNA聚合酶緩沖液2.5μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌超純水18 μl。PRRSV檢測(cè)PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min后，94℃ 20 s、42℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，然后94℃ 20 s、47℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 15 min。PCV2檢測(cè)PCR反應(yīng)條件為：95℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min。〖JP〗1.8.4 電泳 PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物加入2 μl 6×上樣緩沖液用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用100 bp DNA梯度Marker作為參照。PRRSV和PCV2的預(yù)期PCR產(chǎn)物大小分別為255 bp和263 bp。2 結(jié)果 2.1 剖檢表現(xiàn) 所有豬均表現(xiàn)為肺充血、出血和間質(zhì)性
肺炎，脾臟腫大，腎臟色淡，少數(shù)豬有心包積液和鼻腔黏液。2.2 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 心血和心包液染色鏡檢后未見有細(xì)菌，鼻腔分泌物中也未見可疑細(xì)菌，心血和心包液接種綿羊血平板和巧克力瓊脂也未見有細(xì)菌生長(zhǎng)。2.3 豬瘟抗原檢測(cè)結(jié)果 將病料組織觸片后通過熒光抗體染色后，在熒光顯微鏡下可見完整細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量黃綠色熒光，結(jié)果見圖1。2.4 PCR檢測(cè)結(jié)果 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果表明，PRRSV和PCV2 PCR檢測(cè)產(chǎn)物大小分別255 bp和263 bp，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見圖2。3 討論與分析 3.1 隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的提高，種豬和生豬跨地域運(yùn)輸越來越頻繁，使得豬群傳染病的發(fā)生越來越復(fù)雜。在很多豬場(chǎng)，都同時(shí)存在多種病原的混合感染。本文所報(bào)道的豬場(chǎng)經(jīng)過診斷，同樣也是被確診為豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型3種病毒的混合感染。3.2 該場(chǎng)引進(jìn)每一批豬后，均及時(shí)用5倍劑量的豬瘟
兔化弱毒疫苗進(jìn)行免疫，但是仍然發(fā)生了豬瘟疫情，原因可能有：(1)由于免疫豬的免疫狀況背景不清楚，可能在引進(jìn)前抗體水平較低，甚至已經(jīng)發(fā)生了豬瘟病毒的感染。(2)根據(jù)現(xiàn)階段的豬瘟流行的嚴(yán)重程度，很多豬場(chǎng)所采取的免疫程序中，均安排了多次豬瘟疫苗的免疫接種，而該場(chǎng)僅在引進(jìn)后進(jìn)行了一次免疫接種，因而可能不能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。(3)該場(chǎng)還同時(shí)存在豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒2型的混合感染，而這兩種病毒根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，感染后均能夠造成宿主的的免疫抑制，因此可能會(huì)感染豬瘟疫苗免疫效力的發(fā)揮，而且該場(chǎng)并未接種除豬瘟疫苗以外的其他疫苗，因而對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征等疾病高度易感。3.3 針對(duì)該場(chǎng)的現(xiàn)狀，筆者建議：(1)暫停從引進(jìn)外來豬只，對(duì)已經(jīng)發(fā)病的豬只進(jìn)行撲殺和嚴(yán)格的無害化處理，對(duì)同群豬用豬瘟兔化弱毒苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗進(jìn)行緊急接種，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生和定期消毒。(2)在所有豬只都出欄后，全場(chǎng)徹底消毒，并空?qǐng)?～3個(gè)月以上。(3)逐步建立自繁自養(yǎng)制度。(4)不同年齡的豬分群飼養(yǎng)并固定專人管理。(5)制定合理的免疫程序。該場(chǎng)在采納了上述的建議后，豬場(chǎng)發(fā)病率逐漸下降。
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2005年底江蘇某豬場(chǎng)飼養(yǎng)的商品肉豬群中部分豬只陸續(xù)發(fā)生高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸困難等癥狀，病程一般持續(xù)5～7天，發(fā)病豬一般以死亡為轉(zhuǎn)歸，發(fā)病豬在瀕死前發(fā)生全身抽搐等神經(jīng)癥狀。不同年齡段的豬群中均有不同程度的發(fā)生，臨床表現(xiàn)基本相似。通過臨床病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷相結(jié)合的方法，診斷為豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征，豬圓環(huán)病毒2型混合感染。1 材料與方法 1.1 細(xì)菌培養(yǎng)基 巧克力培養(yǎng)基、綿羊血平板均按常規(guī)方法制備。1.2 熒光抗體 FITC標(biāo)記的豬瘟熒光抗體購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。1.3 PCR引物 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)特異的PCR引物參照Gilbert等的方法合成，引物序列為：PRRSVF：5′CCTCCTGTATGAACTTGA3′；PRRSVF：5′AGGTCCTCGAACTTGAGCTG3′。豬圓環(huán)病毒2型（Porcing circovirus type 2，PCV2)特異的PCR引物參照Larochelle等的方法合成，引物序列為：PRRSVF：5′TAGGTTAGGGCTGTGGCCTT3′；PRRSVF：5′CCGCACCTTCGGATATACTG3′�！糑G-6〗所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。1.4 分子生物學(xué)試劑 MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega 公司；dNTP、RNAsin、Taq DNA聚合酶、等購自大連TaKaRa公司；Trizol購自上海生工生物工程有限公司；100bp DNA 梯度Marker購自MBI公司。1.5 病料采集 對(duì)部分發(fā)病比較嚴(yán)重的或剛剛死亡的豬進(jìn)行仔細(xì)剖檢，分別采集鼻腔分泌物、心包液、心血、心、肝、脾、肺、腎等病料，供實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用。1.6 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn) 將采集的鼻腔分泌物、心血、心包積液分別涂片，革蘭氏染色后進(jìn)行顯微鏡檢查。同時(shí)將心血和心包積液接種綿羊血平板和巧克力瓊脂，37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。1.7 豬瘟抗原檢測(cè) 采用間接免疫熒光試驗(yàn)法，取病、死豬的扁桃體、淋巴結(jié)、脾進(jìn)行組織觸片，自然干燥后用冷丙酮-20℃固定20 min，再用PBS（pH7.2)洗滌3次，每次5 min，滴加豬瘟熒光抗體，37℃濕盒作用30 min，用PBS洗滌3次，每次5 min，干后滴加甘油緩沖液封片，熒光顯微鏡檢查。1.8 PRRSV和PCV2的PCR檢測(cè)1.8.1 核酸提取 病料RNA和DNA用Trizol試劑提取，按照說明書提供的方法進(jìn)行。首先將病料剪碎，用研磨器勻漿后制成1∶10懸液，取100 μl樣品加入1 ml Trizol試劑，混勻后室溫作用5 min，加入200 μl氯仿，振蕩混勻后室溫作用5 min，12 000 r/min離心5 min，將上清移入新的滅菌指形管中，加入等體積的異丙醇，混勻后室溫放置5 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀兩次，室溫吹干，用30 μl DEPC處理的滅菌超純水溶解沉淀。一半用PRRSVR引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，另一半直接用作PCV2的PCR檢測(cè)。1.8.2 反轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄體系為25 μl，其中含5×MMLV緩沖液5 μl，RNA 12.5 μl，2.5 mmol dNTP 5 μl，PRRSVR引物1 μl，RNAsin 0.5 μl，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl�；靹蚝�，37℃作用1 h，95℃作用5 min滅活MMLV反轉(zhuǎn)錄酶。1.8.3 PCR試驗(yàn) PCR反應(yīng)體系為25 μl，其中含10×Taq DNA聚合酶緩沖液2.5μl，2.5 mmol dNTP 2 μl，上、下游引物各0.5 μl，模板2 μl，Taq DNA聚合酶1 μl，滅菌超純水18 μl。PRRSV檢測(cè)PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min后，94℃ 20 s、42℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，然后94℃ 20 s、47℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72℃ 15 min。PCV2檢測(cè)PCR反應(yīng)條件為：95℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃ 1 min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 10 min�！糐P〗1.8.4 電泳 PCR反應(yīng)結(jié)束后，取10 μl PCR產(chǎn)物加入2 μl 6×上樣緩沖液用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用100 bp DNA梯度Marker作為參照。PRRSV和PCV2的預(yù)期PCR產(chǎn)物大小分別為255 bp和263 bp。2 結(jié)果 2.1 剖檢表現(xiàn) 所有豬均表現(xiàn)為肺充血、出血和間質(zhì)性肺炎，脾臟腫大，腎臟色淡，少數(shù)豬有心包積液和鼻腔黏液。2.2 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 心血和心包液染色鏡檢后未見有細(xì)菌，鼻腔分泌物中也未見可疑細(xì)菌，心血和心包液接種綿羊血平板和巧克力瓊脂也未見有細(xì)菌生長(zhǎng)。2.3 豬瘟抗原檢測(cè)結(jié)果 將病料組織觸片后通過熒光抗體染色后，在熒光顯微鏡下可見完整細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量黃綠色熒光，結(jié)果見圖1。2.4 PCR檢測(cè)結(jié)果 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果表明，PRRSV和PCV2 PCR檢測(cè)產(chǎn)物大小分別255 bp和263 bp，與預(yù)期大小相符，結(jié)果見圖2。3 討論與分析 3.1 隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的提高，種豬和生豬跨地域運(yùn)輸越來越頻繁，使得豬群傳染病的發(fā)生越來越復(fù)雜。在很多豬場(chǎng)，都同時(shí)存在多種病原的混合感染。本文所報(bào)道的豬場(chǎng)經(jīng)過診斷，同樣也是被確診為豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型3種病毒的混合感染。3.2 該場(chǎng)引進(jìn)每一批豬后，均及時(shí)用5倍劑量的豬瘟兔化弱毒疫苗進(jìn)行免疫，但是仍然發(fā)生了豬瘟疫情，原因可能有：(1)由于免疫豬的免疫狀況背景不清楚，可能在引進(jìn)前抗體水平較低，甚至已經(jīng)發(fā)生了豬瘟病毒的感染。(2)根據(jù)現(xiàn)階段的豬瘟流行的嚴(yán)重程度，很多豬場(chǎng)所采取的免疫程序中，均安排了多次豬瘟疫苗的免疫接種，而該場(chǎng)僅在引進(jìn)后進(jìn)行了一次免疫接種，因而可能不能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力。(3)該場(chǎng)還同時(shí)存在豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒2型的混合感染，而這兩種病毒根據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，感染后均能夠造成宿主的的免疫抑制，因此可能會(huì)感染豬瘟疫苗免疫效力的發(fā)揮，而且該場(chǎng)并未接種除豬瘟疫苗以外的其他疫苗，因而對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征等疾病高度易感。3.3 針對(duì)該場(chǎng)的現(xiàn)狀，筆者建議：(1)暫停從引進(jìn)外來豬只，對(duì)已經(jīng)發(fā)病的豬只進(jìn)行撲殺和嚴(yán)格的無害化處理，對(duì)同群豬用豬瘟兔化弱毒苗和豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗進(jìn)行緊急接種，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生和定期消毒。(2)在所有豬只都出欄后，全場(chǎng)徹底消毒，并空?qǐng)?～3個(gè)月以上。(3)逐步建立自繁自養(yǎng)制度。(4)不同年齡的豬分群飼養(yǎng)并固定專人管理。(5)制定合理的免疫程序。該場(chǎng)在采納了上述的建議后，豬場(chǎng)發(fā)病率逐漸下降。
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