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實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié) 原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用

自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來(lái)近20余年內(nèi),這一技術(shù)為基因的定位和表達(dá)、基因進(jìn)化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料,發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來(lái),此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大并在兩個(gè)主…

自Gall和Pardue建立了原位雜交技術(shù)以來(lái)近20余年內(nèi),這一技術(shù)為基因的定位和表達(dá)、基因進(jìn)化、發(fā)育生物學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)、病毒學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和遺傳分析等領(lǐng)域研究提供了極其寶貴的資料,發(fā)揮了其它技術(shù)難以取代的作用。近年來(lái),此一技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大并在兩個(gè)主要進(jìn)行了技術(shù)法的改進(jìn)。一方面是應(yīng)用一系列放大手段增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度(詳見二十二章 ),另一方面是提高其分辨率,即向電鏡水平發(fā)展。Jacob(1971)首先用3H標(biāo)記的核酸RNA探針與DNA雜交并在電鏡水平顯示獲得成功,繼后不少科技工作者在這方面做了大量的工作(Manning et al 1975,Steinert et al1976,Hutchison et al 1982)。但所應(yīng)用的均是同位素標(biāo)記核酸探針,直到1986年Binder首先用生物素標(biāo)記的rDNA及UI探針,在蜂蠅(Drosophila)卵巢,應(yīng)用Lowicryl-K4M低溫包埋的切片上進(jìn)行原位分子雜交,以蛋白A和膠體金復(fù)合物作為顯示系統(tǒng),較好的保存了組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和較高的信噪比例。Webster等人(1986)應(yīng)用生物素標(biāo)記探針顯示了細(xì)胞內(nèi)mRNA的分布。Singer等(1989)成功的用雙標(biāo)記原位雜交技術(shù),一方面檢測(cè)整裝抽提細(xì)胞內(nèi)與骨架結(jié)合的mRNA,同時(shí)顯示了該mRNA所表達(dá)的蛋白質(zhì)。新近Fischer等利用地高辛標(biāo)記rRNA探針在Lowicryl-K4M包埋的切片進(jìn)行雜交,然后以抗地高辛等抗體結(jié)合膠體金顆粒進(jìn)行顯示,以銀顯示法加強(qiáng)獲得極為滿意的定位?傊婄R水平的原位分子雜交技術(shù)在國(guó)外還處在不斷提高和改進(jìn)的階段,在國(guó)內(nèi)此一技術(shù)還剛起步。焦仁杰等(1992)報(bào)告了以生物素標(biāo)記腺病毒的基因組探針與整裝抽提的細(xì)胞進(jìn)行電鏡原位雜交技術(shù),成功地證明了腺病毒DNA與核骨架的緊密結(jié)合關(guān)系,膠體金顆粒呈簇狀與串珠狀結(jié)合在核骨架上。向正華等(1994)應(yīng)用地高辛標(biāo)記探針結(jié)合HRP的包埋前染色法顯示了POMc mRNA定位于神經(jīng)元的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。下面列舉幾種代表性的電鏡原位雜交技術(shù)。

一、應(yīng)用同位素標(biāo)記cRNA探針電鏡原位雜交技術(shù)于染色體制片(Hutchison et al,1982)

(1)將整封染色體鋪片放置于金網(wǎng)上,在70%的酒精蒸汽固定4~15h,空氣干燥。

(2)以強(qiáng)堿使DNA變性,將金網(wǎng)置于2×SSC內(nèi)(應(yīng)用0.1n NaOH調(diào)整至pH12),室溫,2min。

(3)脫水,以70%和95%酒精各沖洗3次,空氣干燥。

(4)雜交,金網(wǎng)覆于平面玻璃皿( Petri dish)內(nèi)的雜交液滴上,每滴約10~15μl,將此小碟置于盛于雜交緩沖的大塑料盒內(nèi),保持濕潤(rùn),在60~65℃孵育4~24h。

雜交液的配制:6×SSC或6×TNS(1×TNs =0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris,Ph6.8,含30000~50000cpm/10μl3h cRNA)。

(5)雜交后沖洗,金網(wǎng)自雜交液中取出后立即用大量的2×SSC沖洗多次。RNA酶溶液(20μg/ml)室溫沖洗,然后再用2×SSC室溫沖洗,沖洗后梯度酒精脫水(70%,95%)空氣干燥。

(6)浸入乳膠膜,應(yīng)用L-4核乳膠液,水稀釋4倍。浸膜后的金網(wǎng),用膠帶固定在載玻片上放在密封的黑色塑料盒內(nèi),4℃,時(shí)間根據(jù)同位素種類和靶mRNA含量而定,也可選擇不同時(shí)間曝光,根據(jù)顯影強(qiáng)弱確定最終顯影的時(shí)間。

(7)顯影。暗盒自冷房或冰箱中取出后,在室漸中回暖至少30min,以防核乳膠膜皺縮。然后在顯影液(Kodax Microdol X)顯影3~5min,溫度18~24℃。水沖,在15% Kodax快速定影液定影5min,然后在空氣中干燥。

所有溶液應(yīng)盡可能新鮮配制。

(8)電鏡觀察。

二、應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針電鏡原位雜交技術(shù)

(一)基本原理

應(yīng)用DNA探針缺口翻譯(nick translation)方法,通過堿基配對(duì)以一條DNA鏈為模板,將生物素標(biāo)記的某一種脫氧三磷酸核苷酸如Bio-dUTP滲入有缺口的DNA鏈。將生物素標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交。顯示方法有二種:一種是用HRP顯示,類似免疫電鏡技術(shù)中采取的包埋前染色法,利用地高辛-過氧化物酶HRP顯色法進(jìn)行光鏡水平的厚片原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)染色,其步驟與第二十章 敘述的原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)基本方法相同,只是為了減少細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的損傷,在包埋過程中減少H2O2和Triton X-10等易損傷細(xì)胞與組織結(jié)構(gòu)的試劑用量(向正華等1993)。在顯色完畢后,取反應(yīng)陽(yáng)性部位按常規(guī)電鏡操作程序進(jìn)行鋨酸后固定,脫水,包埋,切片和觀察。此法利用HRP免疫反應(yīng)產(chǎn)物具有極高電子反應(yīng)密度體積大小不一,加之非特異性反應(yīng)產(chǎn)物常掩蓋微細(xì)結(jié)構(gòu)的背景,不易達(dá)到準(zhǔn)確的定位。現(xiàn)在比較廣泛應(yīng)用的是生物素-蛋白A(PA)膠體金(gold)標(biāo)記技術(shù)。用于原位雜交的電鏡定位,取得較為滿意的效果。其基本原理是利用生物素標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織進(jìn)行原位雜交后,利用抗生物素抗體-結(jié)合蛋白A-金標(biāo)記雜交體的超微結(jié)構(gòu)定位,類似免疫電鏡中的包埋后染色。在包埋劑應(yīng)用方面,有報(bào)告應(yīng)用環(huán)氧樹脂包埋獲得成功的。但大多數(shù)較滿意的結(jié)果均獲自低溫親水性包埋劑——Lowicryl-K4M,也有應(yīng)用LR-white作為包埋劑的(詳見第七章 )。

(二)應(yīng)用生物素標(biāo)記DNA探針-PA-gold電鏡雜交技術(shù)(Binder et al,1986)

1.固定現(xiàn)認(rèn)為應(yīng)用4%多聚甲醛加0.1%戊二醛在磷酸緩沖液中(pH7.4),為較理想的固定劑,也有主張單純用4%多聚甲醛的,因經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明如應(yīng)用高濃度4%的戊二醛比用多聚甲醛樣品其雜交率減低60%。但作者認(rèn)為應(yīng)用少量戊二醛可較好的保持細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。也有報(bào)告用酒精/醋酸混合液的。多聚甲醛-戊二醛固定時(shí)間在15min至1h。然后放入Ringer氏液或PBS,在4℃含7%蔗糖的0.15mol/L磷酸緩沖液中儲(chǔ)存過夜。

2.脫水次日,用0.15mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)沖洗30min,然后進(jìn)行脫水,①65%乙二醇,0℃,60min;②80%乙醇-35℃,120min;③100%K4M:80%乙醇 =1:1,-35℃,120min;m.payment-defi.com/wszg/④100%K4M:80%乙醇=2:1,-35℃,60min;⑤100%K4M -35℃,過夜。

3.包埋 按照Roth et al(1981),組織塊包埋于盛有K4M的膠囊中,在-35℃紫外線燈(波長(zhǎng)360nm)照射聚合24~48h。取出后置室溫,用紫外線燈繼續(xù)照射24h,使變硬易于進(jìn)行超薄切片。膠囊短期可保存于室溫,如需長(zhǎng)期保存,宜置于-70℃冰箱中,可保存近1年。

K4M配制(中等硬度)

交聯(lián)接劑(cross-linker)2.7mg

單體(monomer)17.3mg

引發(fā)劑(initiator)0.10mg

可根據(jù)硬度需要調(diào)整各化合物比例。增加交聯(lián)劑的量,組織塊的硬度增加。

4.切片超薄切片50~60nm,撈于有覆有Formavar和碳膜的鎳網(wǎng)上。

5.組織前處理和預(yù)雜交用含0.2mol/l Tris緩沖液的0.1mol/L甘氨酸(Ph7.4)沖洗15min,以除去醛類固定劑對(duì)雜交和檢測(cè)的影響,然后2×SSC沖洗15min,再用變性液(70%去離子甲酰胺,2×SSC)在65℃處理樣品5~10min,以達(dá)到變性的目的。變化后的樣品在預(yù)雜交液中(50%去離子甲酰胺,0.5mol/l NaCl, 10mmol/L Tris,1mmol/LEDTA,pH7.5)37℃預(yù)處理15min。

6.雜交鎳網(wǎng)載有切片面覆蓋于雜交液滴(約20μl)上,置于濕盒內(nèi)37℃,1~2h。雜交液成份與光鏡原位雜交免疫細(xì)胞化學(xué)相同(詳見第二十章 ),如為DNA探針須在沸水中先煮2~3min,以使之變性,然后迅速移至冰浴。

整個(gè)雜交過程須注意防止鎳網(wǎng)上的雜交液干掉。

7.雜交后漂洗

含50%甲酰胺的2×SSC液37℃30min

含50%甲酰胺的1×SSC液室溫30min

無(wú)甲酰胺的1×SSC液室溫20min

樣品置1×SSc  4℃過夜

0.01mol/LPBS(pH7.2) 室溫10min

4%BSA 封閉 15min

8.羊抗生物素IgG抗體(sigma)1:100(稀釋用PBS液:2%NaCl, 0.05% KCl, 0.05% KH2PO4,0.278% Na2HPO4,另加300mmol/L NaCl, 0.5% Triton X-100)室溫反應(yīng)2h。

9.含0.1% BSA的PBS液洗3×30min。

10.抗羊IgG的IgG相連10nm膠體金(Sigma)1:100(稀釋用1%BSA緩沖液:20mmol/l Tris –HCl, pH8.2,0.9% NaCl,0.02mol/L疊氮鈉,0.5%Triton X-100),室溫反應(yīng)1h。

11.1%BSA緩沖液3×30min,PBS(pH7.2)15min,蒸餾水洗5min,空氣干燥。

12.醋酸雙氧鈾染色20min,檸檬染色15min,空氣干燥后電鏡觀察。

應(yīng)用本法標(biāo)記有如下優(yōu)點(diǎn):(1)可獲迅速的信號(hào)檢測(cè);(2)形態(tài)學(xué)保存較好;(3)與放射性同位素原位分子電鏡雜交技術(shù)的信/噪比例相近。是目前公認(rèn)在電鏡水平應(yīng)用同位素標(biāo)記原位雜交技術(shù)較為理想的方法。膠體金顆粒電子密度高,明顯地區(qū)別于非特異性染色與污染,能達(dá)到較為滿意的超微結(jié)構(gòu)定位。本技術(shù)的難點(diǎn)在于:①實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng);②親水性低溫包埋劑制作切片,由于親水性強(qiáng),撈取比較困難,切片易于破裂;③探針的純度與雜交后徹底的漂洗,這是本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)系,而徹底的漂洗又易導(dǎo)致鎳網(wǎng)切片的破裂,作用推薦應(yīng)用大量漂洗液或漂洗中設(shè)置多個(gè)漂洗杯,勤換漂洗液,或用軟塑料瓶加筆狀噴頭,增加水壓等方法,但不論漂洗或噴水沖洗都必須注意水流與網(wǎng)面平行而不能垂直,否則更易導(dǎo)致切片的破裂。④雜交時(shí)間:Binder等證明雜交1h即可出現(xiàn)特異性,到5h之內(nèi)不斷增加。Lawrence和Singer(1985)實(shí)驗(yàn)也表明雜交后3~4h雜交時(shí)特異性就可達(dá)到最大值,雖然此后雜交仍繼續(xù)進(jìn)行,雜交率并不再增加。焦仁杰等(1992)對(duì)整裝細(xì)胞的試驗(yàn)也與上述實(shí)驗(yàn)相同,他們發(fā)現(xiàn)雜交4h和雜交20h相當(dāng),但前者的結(jié)構(gòu)保存要好得多。他們實(shí)驗(yàn)表明,切片標(biāo)本的雜交時(shí)間大約需9~10h。因此,選擇最短而又最有效的雜交時(shí)間對(duì)有效地保持形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是十分重要的。Binder認(rèn)為生物素PA-Gold電鏡雜交技術(shù)所需理想雜交時(shí)間為1~2h。⑤應(yīng)用含甲酰胺(formamide)的緩沖液漂洗易導(dǎo)致金粒聚集的非特異性背景,因此Binder在實(shí)驗(yàn)后建議試用以PBS緩沖液漂洗5×10min代替含甲酰胺的鹽液,經(jīng)證明可避免或減少這種非特異性染色;⑥多數(shù)作者發(fā)現(xiàn)應(yīng)用K4M包埋劑在電鏡雜交技術(shù)是最理想的,其結(jié)果可與無(wú)包埋劑的培養(yǎng)細(xì)胞涂片、染色體鋪片等的信/噪比值相等。

雖然生物素-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片獲得了較為滿意的結(jié)果,但Lawarence和singer(1985)在比較了三種檢測(cè)系統(tǒng)的信/噪(signal/Noise,S/N)得到的結(jié)果是32P標(biāo)記為70、3H標(biāo)記為20、而生物素標(biāo)記的S/N值最低,為10。Webster等(1987)同時(shí)比較了生物素標(biāo)記P0-HRP糖蛋白cDNA探針(包埋前染色)和生物素標(biāo)記P0-糖蛋白cDNA探針-蛋白A-膠體金(包埋后染色)電鏡雜交技術(shù),觀察15天大鼠三叉神經(jīng)節(jié) 雪旺氏細(xì)胞髓鞘的標(biāo)記,固定劑應(yīng)用PLA溶液(4%多聚甲,15%(V/V)飽和苦味酸)和0.08%戊二醛(用磷酸緩沖液配),二者均獲顯示,但作者仍認(rèn)為應(yīng)用PA-Gold電鏡雜交技術(shù)在K4M包埋切片上進(jìn)行載網(wǎng)雜交的顯示結(jié)果以及形態(tài)保存更為理想。

三、應(yīng)用地高辛標(biāo)記rRNA探針的電鏡原位雜交技術(shù)

(一)基本原理

在地高辛標(biāo)記核酸探針廣泛用于光鏡水平的原位雜交試驗(yàn)并獲極為滿意的結(jié)果后,科學(xué)工作者試圖將其應(yīng)用于電鏡水平。其基本原理和生物素標(biāo)記核酸探針-PA-Gold電鏡雜交技術(shù)的基本原理相似,首先利用地高辛修飾核酸探針,與細(xì)胞或組織進(jìn)行雜交,再用抗地高辛抗血清相連膠體金與之結(jié)合,進(jìn)行細(xì)胞或組織特異核苷酸的超威結(jié)構(gòu)定位。為增強(qiáng)金的顯示效應(yīng),可用銀加強(qiáng)法增強(qiáng)金粒的顯示效應(yīng)。

(二)基本操作方法(Fischer D et al, 1992)

1.組織處理

(1)固定:固定劑采用4%多聚甲醛(PFA,用PBS配制)加0.5%戊二醛(GA),保存在4℃。作者采取浸入法,即取大鼠肝臟放入冷固定劑中(4%PFA,不含GA),切成1mm3左右的小方塊。修整好的組織塊移入另一玻皿中,內(nèi)盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。

(2)PBS(4℃)漂洗3~5min。

(3)脫水

時(shí)間乙醇濃度溫度

2×15min 30%4℃

30min 30%4℃

30min 50% -20℃

2×30min  70%,90%,96%,100% -20℃

注意勿使酒精揮發(fā)致使組織干燥。

(4)浸透和包埋(Carlemalarm et al, 1989):由于K4M包埋劑有揮發(fā)性,因此,此步操作者必須帶手套,在通風(fēng)柜中進(jìn)行,注意K4M包埋劑不要靠近O2,一切在低溫下進(jìn)行,最好設(shè)有恒低溫的冷柜。

①Lowcryl K4M配方

1)交聯(lián)劑A  2g

2)單體B 13g

3)引發(fā)劑0.075g

混合1),2)后,再加“3)”輕攪勻,混勻后置于-20℃。

②浸透(infiltration),在-20℃進(jìn)行

時(shí)間液體

1h100%乙醇:K4M(1:1,V/V)

2×1h K4M

過夜 K4M

2×3h K4M

③包埋: 先將膠囊冷卻,滴入幾滴K4M,然后每個(gè)膠囊內(nèi)放入一個(gè)組織塊,以K4M充滿膠囊,在室溫放置30min,使包埋劑中氣泡逸出。然后置于0℃-40℃之間,利用紫外線燈360nm波長(zhǎng)照射5天,溫度必須保存恒定。然后移至室溫使溫度回升,膠囊變硬。

④切片:由于膠囊是透明的,包埋在內(nèi)的肝組織很容易識(shí)別。修塊后進(jìn)行切片,由于K4M是親水性的,在切片過程中注意組織塊表面一定不要讓水浸濕,用200個(gè)網(wǎng)眼的鎳網(wǎng)覆以For-mvar膜和碳膜撈取切片,空氣干燥備用于雜交。

2.探針準(zhǔn)備rRNA探針以Dig-UTP標(biāo)記,注意探針不宜過長(zhǎng),否則影響對(duì)組織的穿透性。如過長(zhǎng),可事先用第二十章 介紹的探針?biāo)夥ㄌ幚怼?/p>

3.雜交本步驟均在濕盒內(nèi)進(jìn)行,將雜交液滴滴于蠟?zāi)ど希瑢㈡嚲W(wǎng)載有切片面覆于液滴上,在65℃雜交至少3h。雜交液含:5×SSC,0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探針10ng/μl(et 1×SSC配,含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸鈉)。

4.雜交后漂洗在室溫用2×SSC漂洗3×5min,然后用PBST(PBS,0.1%Tween)漂洗2×10min。

5.顯示

①以PBST加BT封閉(BT配方:PBST,1%BSA)孵育15min。

②應(yīng)用抗地高辛抗體結(jié)合直徑1mm的金粒,以PBST加BG稀釋為1:30,室溫孵育1h。

③以PBST漂洗3×5min。

④以帶筆尖嘴軟塑料壺沖洗6×15min。

⑤以銀增強(qiáng)法,在暗室中孵育于顯影液:促進(jìn)液(Enhancer)1:1,4~20min。

⑥重復(fù)④。

⑦以2%醋酸鈾(4min),枸緣酸鉛1min染色,漂洗,空氣干燥。

⑧電鏡觀察。

四、結(jié)語(yǔ)

原位分子雜交技術(shù)在電鏡水平的應(yīng)用,或簡(jiǎn)稱為電鏡原位分子雜交技術(shù)是基因表達(dá)在超威結(jié)構(gòu)定位的一項(xiàng)極有前景的新興技術(shù)。但要使之完善,還需要做許多工作。必須說(shuō)明的是電鏡原位雜交技術(shù)和光鏡原位雜交技術(shù)一樣必須設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)組,對(duì)顯示的結(jié)果的解釋應(yīng)持審慎的態(tài)度。一般應(yīng)在重復(fù)多次實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上才能得出對(duì)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論,不能只憑一次實(shí)驗(yàn)或一張電鏡照片就勿忙結(jié)論。因原位雜交技術(shù)是高度敏感、高度特異性技術(shù),影響因素很多。電鏡原位雜交技術(shù)的影響和干擾因素更多。相信在不久的將來(lái),隨著電鏡原位雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用,科技工作者將從實(shí)踐中對(duì)本技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程不斷完善并有更多的新的電鏡原位雜交技術(shù)方法涌現(xiàn)。

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