五、核酸分子雜交的類型
隨著基因工程研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中。
由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復性等優(yōu)點，故該法最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
液相雜交是一種研究最早且操作復合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。其主要原因是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應(yīng)用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。下面對固相雜交和液相雜交分別進行介紹。
（一)固相膜核酸分子雜交方法
固相核酸雜交多是在膜上進行，因此，以下主要介紹固相膜的核酸分子雜交方法：
1．DNA的變性 DNA變性解鏈是雜交成功的關(guān)鍵。Southern印跡雜交時DNA在凝膠中變性，變性方法是將凝膠浸在數(shù)倍體積的1.5mol/l NaCl和0.5mol/l NaOH中1h然后用數(shù)倍體積的1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和1.5mol/l NaCl溶液中和1h。DNA受酸、堿、熱等處理均能發(fā)生變性，但強酸會使核酸降解。一般認為堿變性較好，可避免DNA降解。熱變性在要低DNA濃度（100μg/ml)和低鹽濃度（0.1mol/l SSC 含15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L檸檬酸三鈉，pH7.0)下進行。用SSC稀釋DNA溶液為50μg/ml,加10mol/l NaOH使最終濃度為0.1mol/L（pH約12.8)，室溫變性10min，很快置冰鹽水中，用10min/l HCl或5mol/l NaH2PO4調(diào)pH到7～8[亦可用堿變性后，調(diào)至中性，再加熱100。c 10min]，DNA變懷可用OD260增加（約30%～40%)來檢測，變性DNA醇沉淀呈雪樣，完全失去纖維狀沉淀。變性后加入等量冷的12×SSC，冰浴保存。
2．變性DNA在硝酸纖維素膜上的固定 硝酸纖維素濾膜（孔徑0.45μm)先在蒸餾水中充分浸泡，再用6×SSC浸泡30min～2h，涼干。DNA樣品轉(zhuǎn)移或加至硝酸纖維素膜上后，先室溫干燥4h，然后在80。C真空干燥2h。
3．預雜交 濕潤的濾膜放入可加熱封口的塑料袋中，按每平方厘米濾膜加0.2ml預熱至60。C的預雜交液（6×SSC，0.5%,SDS,5×Denhardt液，100μg/ml鮭魚精DNA)。鮭魚精DNA需經(jīng)過剪切和DNA酶消化處理，然后酒精沉淀純化，調(diào)濃度至10mg/ml，用前放100。C水浴中煮沸變性10min，冰水驟冷。盡可能將袋中氣泡趕盡，可封口器將袋口封住。將雜交袋浸入68。C水浴保溫3~12h。當預雜交液溫度升至68。C時，在濾膜表面常會形成小氣泡。輕輕晃動袋中液體即可除去這些小氣泡，這一點對于保證濾膜表面充分浸潤預雜交液很重要。
4．雜交 從水浴中取出塑料袋，用剪刀剪開一角，盡可能擠凈預雜交液。用吸管或大槍頭將雜交液加入袋中，用恰好是足量的液體保持濾膜濕潤（50μl/cm2)。溶液的組成是6×SSC，0.01mol/l EDTA, 變性的標記核酸探針，5×Denhardt液，0.5%SDS, 100μg/ml變性的鮭魚精DNA。盡可能趕盡氣泡后，將塑料袋嚴密封口，雜交反應(yīng)在68℃水浴中進行，所需時間視探針和檢測靶DNA的性質(zhì)及探針的比活性等情況而定，一般4～20h。
5．洗膜 取出塑料袋，用剪刀剪開，小心取出濾膜，立即浸入盛有2×SSC和0.5%SDS溶液的盤中，室溫下漂洗5min。再將濾膜移入2×SSC和0.1%SDS溶液中，室溫下洗滌15min（輕輕搖動)。然后將濾膜移入0.1×SSC和0.5%SDS溶液中；68℃輕輕搖動保溫2h，更換緩沖液后繼續(xù)保溫30min。
洗膜的溫度一般應(yīng)控制在低于Tm值12℃以上。（Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %)。雙鏈DNA的Tm值隨錯配堿基對數(shù)每增加1%而遞減1℃。
6．結(jié)果顯示 非放射性檢測方法前已述及，此處主要介紹放射性測定方法。固相膜的放射性雜交結(jié)果顯示有兩種方式，一是放射性自顯影法，另一種是液閃計數(shù)法。前一種方法比較簡單，只需將雜交膜與X光片在暗盒中曝光數(shù)小時至數(shù)天，再顯影、定影即可。對于雜交信號較弱的固相膜，用一塊增感屏可顯著增強曝光強度。此外，為了減弱32P的散射，曝光通常在-20℃或-80℃下進行。液閃計數(shù)法主要用于打點和狹縫雜交及為了比較兩個雜交信號的強弱等情形。方法是將完成雜交的膜在漂洗結(jié)束后剪成小塊（每份樣品1塊)，80℃真空干燥后裝閃爍瓶。加入2～5ml閃爍液，剪2～3塊無樣品膜塊作為本底對照。在液體閃爍計數(shù)器上自動計數(shù)。液體計數(shù)測定放射性強度也可在放射自顯影之后進行。
�。ǘ�)固相核酸分子雜交類型
1．菌落原位雜交（Colony in situ hybridization) 菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。
實驗步驟如下：
�、賹⑾跛崂w維素濾膜置于含抗生素的平皿瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌牙簽挑取單菌落種于濾膜和主瓊脂平板上，排列成方格柵，膜和板上菌落位置相同。
�、谂囵B(yǎng)細菌至產(chǎn)生1～2mm大小的菌落。
�、墼谝粔K平皿中置4張濾紙，用10%SDS浸透，倒掉多余液體。將帶有菌落的濾膜取下，輕輕置于濾紙上，菌落面上在，注意防止在濾膜底面存有氣泡。
�、�5min后，將濾膜轉(zhuǎn)至用變性溶液（0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl)浸濕的濾紙上，放置10min。
�、輰V膜轉(zhuǎn)至中和溶液（1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ，pH8.0)浸濕的濾紙上，放置10min。重復中和1次。
�、迣V膜移至用2×SSPE溶液浸過的濾紙上，放置10min。SSPE配成20×貯備液：3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。
�、邔V膜用濾紙吸干，80℃真空烘干2h。
以下操作參考前述。
2．斑點雜交（Dot blot) 斑點雜交法是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds)，如Minifold I和II、Bio-Dot (Bio –Rad )和Hybri –Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復沖洗進樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。
�。�1)DAN斑點雜交
�、傧葘⒛ぴ谒薪䴘�，再放到15×SSC中。
�、趯NA樣品溶于水或TE，煮沸5min，冰中速冷。
③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣于膜上。每個樣品一般點50μl（2～10μg DNA)。
�、軐⒛ず娓�，密封保存?zhèn)溆谩?/P>
�。�2)RNA斑點雜交：與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經(jīng)酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化)。方法是將RNA溶于5μlDEPC水，加15μl甲醛/SSC緩沖液（10×SSC中含0.15mol/l 甲醛)使RNA變性。然后取5～8μl點樣于處理好的濾膜上，烘干。
培養(yǎng)細胞，標本處理技術(shù)可以簡化，不用提取和純化RNA。方法是用含0.5%Nonidet P40的低滲緩沖液對多種動物細胞作簡單處理，離心去掉細胞核和細胞碎片，就得到基本不帶DNA而富含RNA的細胞質(zhì)提取物，這一粗RNA在高鹽下用甲醛變性，不需加工直接點到硝酸纖維素膜上。本法可以快速檢測大量標本，而只需極少量的細胞（5×104)或組織。
整個RNA實驗中，要防止激活內(nèi)源性RNase，有許多種預防措施，有一種是在樣品中加入核糖核苷氧礬基復合物（RVC)。
�。�3)完整細胞斑點雜交：應(yīng)用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養(yǎng)物的特異序列進行快速檢測。將整個細胞點到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從105個培養(yǎng)細胞中檢測到少至5pg 的Epstein – Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用于篩選大量標本，因為它是使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交。但它不適于非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產(chǎn)生高本底。
3．Southern印跡雜交（southern blot ) Southern blot 是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。Southern印跡雜交基本方法是將DNA標本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置在DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
�。�1)瓊脂糖凝膠電泳：利用瓊脂糖凝膠電泳可以很容易地將DNA限制酶消化片段（0.3～25kb)分離開。分離大分子DNA片段（800～12000bp)用低濃度瓊脂糖（0.7%)，分離小分子片段（500～1000bp)用高濃度瓊脂糖（1.0%),300～5000bp的片段則用1.3%的瓊脂糖凝膠，根據(jù)分離樣品量、分離速度和分辨率要求的不同，可選用不同規(guī)格的電泳槽。
電泳時，同時將標記物加到旁邊孔中，便于確定樣品DNA的分子量。20伏恒壓電泳過夜。電泳畢，將膠浸到含0.5μg/ml EB的TBE緩沖液中染色30min，也可將EB直接加到電泳緩沖液中或在配膠前加入膠中，在254nm短波透射燈下拍照，加橙黃色濾色鏡，使用高速一次成像膠片，光圈f4.5,曝光20～40s。
（2)硝酸纖維素濾膜吸印。
�、賹⒛z切成合適大小，切去右上角作為記號。
�、趯⒛z放進盛有變性緩沖液（1.5mol/l NaCl, 0.5mol/L NaOH)的盤中輕搖動15min。
�、蹞Q到中和緩沖液（1mol/L Tris·HCl , pH8.0, 1.5mol/L NaCl)中輕搖動30min。
④裁一張硝酸纖維素膜，2～4張3MM濾紙和一些吸印紙（可用衛(wèi)生紙)，都與膠的大小相同（硝酸纖維素膜和吸印紙不能比膠大，否則易形成旁路)，先將硝酸纖維素膜浸到水中，再放入10×SSC中，接觸膠和硝酸纖維素膜時都要戴橡膠手套操作。
�、萜奖P上放一塊比膠大的平板（盛膠槽翻過來即可)，上面鋪一張3MM濾紙，起燈芯作用，盤中加少量10×SSC緩沖液（2.5cm厚)，不能沒過平板，使3MM濾紙充分飽和。
�、迣⒛z倒扣到3MM濾紙上。
�、呓䴘竦南跛崂w維素鋪在膠上，對齊，鋪膜時從一邊逐漸放下，防止產(chǎn)生氣泡，有氣泡時，可用吸管趕出，不能讓膜與膠下的濾紙直接接觸。
�、嗄ど戏乓粡�3MM濾紙，不能與膠接觸。
⑨上面加吸印紙及重物（500g左右)。
�、馔ㄟ^濾紙的灶芯作用，平盤中的緩沖液就會通過膠上移，從而將DNA吸印到膜上，及時更換浸濕的吸印紙。在室溫下轉(zhuǎn)印過夜。
⑾去除上面的東西，用鑷了將膜取出，在6×SSC中洗一下（也可不洗)。
�、凶匀桓稍�，80℃烤2h。
�、堰@時的膜就可進行雜交，或室溫密封保存。
4．Northern印跡雜交（Northern blot) 這是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上的方法。DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被趣稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為western blot。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標記物一同電泳，之后將標記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進行Northern轉(zhuǎn)印，標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L 醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mR－NA時，甲基氫氧化汞是一種強力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。
