網(wǎng)站首頁
醫(yī)師
藥師
護士
衛(wèi)生資格
高級職稱
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學考研
醫(yī)學論文
醫(yī)學會議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學全在線 > 理論教學 > 基礎(chǔ)學科 > 免疫細胞與核酸分子雜交 > 正文:DNA重組實驗中常用的技術(shù)
    

DNA重組實驗中常用的技術(shù)

  一、質(zhì)粒DNA的提取及鑒定

 。ㄒ)質(zhì)粒DNA的提取及鑒定

  1.收獲細菌

 。1)將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到通氣良好的15ml的試管中,接入一單菌落,于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。

  (2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中,用臺式離心機于4℃以12000g離心5min,將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。

 。3)吸盡培養(yǎng)液,使細菌沉淀盡可能干燥。

  2.堿裂解法小量抽提質(zhì)粒

 。1)將細菌沉淀[上述步驟(3)所得]重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖,25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中,劇烈振蕩。

  (2)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS),緩和振蕩,水浴5min。

 。3)加150μl預(yù)冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml),緩和振蕩,冰浴5min。

 。4)4℃以12000g離心5min,將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

 。5)可作不可作:加等量飽和酚,氯仿,振蕩混勻,重復(fù)2,(4)。

 。6)用2倍體積無水乙醇室溫沉淀雙鏈DNA,振蕩混合,于室溫放置2min。

 。7)4℃以12000g離心5min。

 。8)小心吸盡上清液,將離心管倒置于一張紙巾上,再將附于管壁的液滴除盡。

 。9)用75%乙醇于4℃洗滌DNA,同上離心去上清真空抽干。

 。10)加50μl的1×TE(含20μg/ml無DNA酶的胰RNA酶),振蕩,貯存于-20℃。

 。ǘ)質(zhì)粒DNA的大量制備

  (1)同上1.(1)

 。2)將1ml含菌液倒入含相應(yīng)抗生素的Lb 100ml中,37℃振蕩培養(yǎng)至A590=1.0(5~6h)。

 。3)加氯霉素(170μg/ml)擴增,37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。

 。4)收集菌液于離心管中,冰浴10min。3000rpm,離心10min,去上清。

 。5)加溶液Ⅰ5ml懸浮菌體,將懸液倒入高速離心管中,搖勻,冰浴5min。

 。6)加溶液Ⅱ10ml輕輕混勻,室溫下5min。

 。7)加溶液Ⅲ7.5ml輕輕混勻,冰浴30min。15000rpm,4℃離心20min。

 。8)取上清液于高速離心管中,加2倍體積的無水乙醇,混勻,入-20℃3~5h。

  (9)15000rpm 4℃ 離心20min。

 。10)棄上清,將離心管倒放入真空泵中抽干(10~15min)。

 。11)用5ml1×TE溶解,加入RNase A 15~20μl,42℃水浴4h于過夜。

  (12)加入5ml飽和酚,混勻,4000~5000rpm離心5min,取上清液入5ml離心管內(nèi)。

 。13)分別加入2.5ml飽和酚,2.5ml氯仿,混勻后同樣離心收集上清。

 。14)加等體積氯仿/異戊醇(24:1)混勻,同樣離心收集上清。

 。15)加入1/10體積的3mol/l NaAc及2倍體積的無水乙醇于-20℃3~5h。

 。16)10000rpm 4℃離心20min。

 。17)棄上清,加入75%乙醇洗滌2次。

 。18)離心棄上清,真空抽干,加入適量1×TE溶解質(zhì)粒DNA。

 。ㄈ)質(zhì)粒DNA的鑒定

  1.酶切反應(yīng)

 。1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer 1μl,DNA 2μl,酶1μl,混勻,37℃水浴1h以上。

  (2)取反應(yīng)物點樣,觀察酶切效果。

 。3)酶切完全后,70℃5min終止反應(yīng)。

  2.瓊脂糖電泳

 。1)配制所需濃度瓊脂糖凝膠。

 。2)在待測的DNA樣品中加1/5體積的溴酚藍指示劑,混勻后點樣。

 。3)打開電源開關(guān),5V/cm電泳。醫(yī)學網(wǎng)站www.med126.com

 。4)在UV燈下觀察電泳結(jié)果。

  二、DNA的重組

  (一)DNA的酶切與連接

 。1)酶切反應(yīng)

  同質(zhì)粒DNA的鑒定,只不過是質(zhì)粒DNA換為載體DNA。若大量酶切,則成比例增加。

 。2)加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻,-20℃2h以上。

 。3)15000rpm離心15min,棄上清。

 。4)加入75%乙醇洗滌2次,離心棄上清,真空抽干。

 。5)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。

  (6)測定DNA的含量。

 。7)加入線性載體DNA和含量3~4倍于載體的待插入DNA片段,連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl,在12~14℃反應(yīng)12~16h。

  (8)連接反應(yīng)液可置-20℃保存,供轉(zhuǎn)化用。

  (9)關(guān)于待插入DNA片段的獲得參見附注。

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] 下一頁

關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學論壇 - 醫(yī)學博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
醫(yī)學全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2026, MED126.COM, All Rights Reserved
浙ICP備12017320號
百度大聯(lián)盟認證綠色會員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗證