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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 免疫細(xì)胞與核酸分子雜交 > 正文:放射免疫分析法的建立
    

放射免疫分析法的建立

  一、放射免疫分析的基本試劑

  (一)標(biāo)準(zhǔn)品

  標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù),由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來(lái)表示被涮物質(zhì)的量,故標(biāo)準(zhǔn)品與被測(cè)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外,還應(yīng)具備穩(wěn)定性,即在合理的貯存條件下保持原來(lái)的特性。

  按實(shí)驗(yàn)要求,將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

 。ǘ)標(biāo)記物

  標(biāo)記抗原應(yīng)具備:①比放射性高,以保證方法的靈敏度;②免疫活性好;③所用的核素的半衰期盡可能長(zhǎng),標(biāo)記一次可較長(zhǎng)時(shí)間使用,這對(duì)來(lái)之不易的抗原尤其重要;④標(biāo)記簡(jiǎn)便、易防護(hù)。

  要準(zhǔn)確測(cè)量B與F的放射性,必須有足夠的放射性強(qiáng)度。所選用的標(biāo)記抗原的量,在使用125I時(shí)達(dá)5000~15000cpm。

 。ㄈ)抗體

  應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)及滴度好的抗體,用于放射免疫測(cè)定。

  根據(jù)稀釋曲線,選擇適當(dāng)?shù)南♂尪,一般以結(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。

 。ㄋ)B與F分離劑

  以2%加膜活性炭溶液為例,2%加膜活性炭溶液的配制:

  活性炭2g(杭州木材廠生產(chǎn),森工牌732型)

  右旋糖酐T200.2g

  加0.1mol/L PB 至100ml

  電磁攪拌1h,然后置于變通冰箱冰箱待用。

 。ㄎ)緩沖液

  放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種,要通過(guò)實(shí)驗(yàn)選用抗體和抗原結(jié)合最高的緩沖液。

  目前最常用的緩沖液有下列幾種:①磷酸鹽緩沖液;②醋酸鹽緩沖液;③巴比妥緩沖液;④Tris –HCl緩沖液;⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用最多。

  在緩沖液中,除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外,還應(yīng)根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目加入下列物質(zhì):①保護(hù)蛋白:常用的有牛血白蛋白或白明膠,濃度為0.1%~0.2%,用以降低試管對(duì)抗原的非特異性吸附。②防腐劑:多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑:如測(cè)定心鈉素等肽類激素時(shí),要加入適量的抑肽酶,用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對(duì)待測(cè)物的降解;又如測(cè)定cAMP、cGMP時(shí),需加入EDTA·2Na,抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑:在測(cè)定甲狀腺激素或測(cè)定某些甾體激素時(shí),必須加阻斷劑,使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素,變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白:采用二抗作B與F分離劑時(shí),要向反應(yīng)液中加入適量與第一抗體同種動(dòng)物的正常血清。在測(cè)定不含有血漿蛋白的樣品時(shí),用PEG沉淀劑分離B、F,必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

  在神經(jīng)肽的RIA時(shí),常用PELH緩沖液,(按1000ml,pH7.6):

  0.1mol/l PB        980.0ml

  0.3mol/L EDTA·2Na     10.0ml

  0.2%洗必泰溶液       10.0ml

  溶菌酶           1.0g

  二、加樣程序

  由于抗原、標(biāo)記抗原和抗體三者加樣次序不同,而出現(xiàn)兩種加樣程序,分述如下:

  (一)平衡飽和加樣程序

  1.基本原理所謂平衡飽和,是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合,也不解離的平衡狀態(tài),稱為飽和狀態(tài),即平衡飽和。所以,有人稱此為飽和分析法。這意味著抗原或被測(cè)抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。

  2.加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)樣品,再加抗血清,最后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)物與抗體有短暫的結(jié)合,提高抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制能力。

  在小分子半抗原的放射免疫分析中,標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的,前者比后者的親合力高。因此,上述加樣程序就更有必要,所以一般都采用先加標(biāo)準(zhǔn)物或樣品和抗血清,后加標(biāo)記物。這樣測(cè)定也比較穩(wěn)定。醫(yī)學(xué)在線www.med126.com

  在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中,如果是雙抗體分離法,抗原和標(biāo)記抗原與抗體三者加樣,可不分先后,有的是標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)記物、抗血清的加樣順序,但一般習(xí)慣還是標(biāo)準(zhǔn)物或血樣、抗血清、標(biāo)記物、然后混勻溫育24~48h,再加雙抗體,繼續(xù)溫育24h,使免疫反應(yīng)達(dá)到平衡。對(duì)一些多肽激素的放射免疫分析,應(yīng)用雙抗體分離法,其流程比較長(zhǎng),這樣的順序同樣可不分先后。

  以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測(cè)定程序?yàn)槔?/P>

 。1)加樣(單位μl;總反應(yīng)體積500μl)

  標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品
  T NSB Bo 5Pg 10Pg 50Pg 100Pg 500Pg 1ng 垂體 下丘腦
管號(hào) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
β-EP標(biāo)準(zhǔn)液 / / / 100 100 100 100 100 100 / /
樣品 / / / / / / / / / 1 100
β-EP抗血清 / / 100 100 100 100 100 100 100 100 100

125-β-EP溶液

100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
緩沖液 / 400 300 200 200 200 200 200 200 299 200

  (2)孵育:4℃,24h

 。3)分離B與F:每管加入2%加膜活性炭溶液300μl,搖勻,立即離心,去上清,測(cè)沉淀(F)的CPM數(shù)。

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