第八章 細(xì)胞凋亡
（Apoptosis)
介紹本章的授課思路、框架和重點(diǎn)、難點(diǎn)內(nèi)容。
第一節(jié) 概述
一、細(xì)胞凋亡的概念
細(xì)胞死亡（apoptosis)是每一個(gè)細(xì)胞必經(jīng)之道，而細(xì)胞凋亡是最常用的細(xì)胞死亡機(jī)制。在多細(xì)胞個(gè)體中生命期的每個(gè)時(shí)期，細(xì)胞凋亡都是組織動(dòng)力學(xué)的基本機(jī)制。不僅在多細(xì)胞個(gè)體中不可缺，甚至有一些單細(xì)胞個(gè)體也會(huì)出現(xiàn)或多或少的細(xì)胞凋亡特征。
在希臘文中，apoptosis這個(gè)字是用來(lái)描述樹葉從枝頭掉落的狀態(tài)。細(xì)胞凋亡(apoptosis)首先被Kerr等于1972年用來(lái)描述一種與細(xì)胞壞死(necrosis)不同的、其過(guò)程被嚴(yán)密控制的細(xì)胞死亡機(jī)制。事實(shí)上，早在1885年Flemming就曾發(fā)表了卵巢濾泡細(xì)胞的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，當(dāng)時(shí)他命名其為染色質(zhì)溶解(chromatolysis)。雖然細(xì)胞凋亡現(xiàn)在被全世界的學(xué)者研究得如火如荼，他當(dāng)時(shí)的描繪并未使學(xué)者們注意到這是一個(gè)與細(xì)胞壞死不同的細(xì)胞死亡機(jī)制。從chromatolysis到apoptosis的被提出，這個(gè)現(xiàn)象被忽視了將近一個(gè)世紀(jì)。
細(xì)胞凋亡概念提出至今還不到30年的時(shí)間，但由于它在保證多細(xì)胞生物的健康生存過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，對(duì)個(gè)體的正常發(fā)育及細(xì)胞凋亡紊亂在病理學(xué)研究中的重要作用，引起了人們對(duì)其機(jī)制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學(xué)界最為熱門話題之一，也是生命科學(xué)界乃至社會(huì)各界爭(zhēng)相投入的研究領(lǐng)域。
那么什么是細(xì)胞凋亡呢？
細(xì)胞凋亡（apoptosis)是在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴(yán)格調(diào)控而發(fā)生的一種生理性細(xì)胞自殺過(guò)程，又稱程序性細(xì)胞死亡（programmd celldeath．PCD)。它是一個(gè)主動(dòng)的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與醫(yī)學(xué)招聘網(wǎng)的過(guò)程。它是一個(gè)不同于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞死亡形式。
二、主要變化
（－)形態(tài)學(xué)變化
1、細(xì)胞膜的變化 ①微絨毛、細(xì)胞突起和細(xì)胞表面皺褶消失。②胞膜迅速發(fā)生空泡化（blebbing)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不斷擴(kuò)張并與胞膜融合，形成膜表面的芽狀突起，稱為出芽（budding)。
2、細(xì)胞質(zhì)的變化 ①胞質(zhì)濃縮：由于胞質(zhì)脫水而導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、致密及固縮（condensation)，是細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化的一大特征。②細(xì)胞器變化：線粒體變大，嵴增多，線粒體增殖并空泡化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)大、增殖并在凋亡細(xì)胞形成自噬體過(guò)程中提供包裹膜。其他多數(shù)細(xì)胞器完整存在，變得致密。
3、細(xì)胞核的變化 核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，形成染色質(zhì)塊，并聚集在核膜的邊緣，呈新月形、馬蹄形或舟狀分布，稱為染色質(zhì)邊聚（margination)；或聚集在核中央，稱為染色質(zhì)中聚。隨著染色質(zhì)進(jìn)一步聚集，核纖維層斷裂消失，核膜在核膜孔處斷裂，兩斷端向內(nèi)包裹將聚集的染色質(zhì)塊分割，形成若干個(gè)核碎片（核殘塊)。
4、凋亡小體形成 胞膜皺縮內(nèi)陷，分割包裹胞質(zhì)，內(nèi)含DNA物質(zhì)及細(xì)胞器，形成泡狀小體稱為凋亡小體（apoptotic body)，這是凋亡細(xì)胞特征性的形態(tài)學(xué)改變。凋亡小體呈圓形、橢圓形或不規(guī)則狀，小體內(nèi)的成份主要是胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片。
5、吞噬 凋亡小體形成后，鄰近細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)識(shí)別其膜外的新的生物大分子磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine)并吞噬和消化。
正常時(shí)磷脂酰絲氨酸位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)后不久，磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外側(cè)（如下圖)，象一面面“小紅旗”插在細(xì)胞表面，以示“我快死了”，巨噬細(xì)胞看到以后就將它及時(shí)吞噬。
6、繼發(fā)性壞死（secondarynecrosis) 在體外實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，由于沒(méi)有巨噬細(xì)胞吞噬凋亡小體，凋亡小體會(huì)發(fā)生腫脹、破裂、溶酶體釋放等細(xì)胞壞死的表現(xiàn)，稱為繼發(fā)性壞死。
（二)生化改變
1.凋亡啟動(dòng)因子
在細(xì)胞凋亡期間盡管線粒體超微結(jié)構(gòu)基本正常，但其功能已發(fā)生顯著改變。凋亡刺激因素使線粒體內(nèi)膜的跨膜電位降低，進(jìn)而使線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore，PTP)開放和線粒體膜通透性增高（如下圖)，導(dǎo)致線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cyto-C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis inducing factor,AIF)、凋亡蛋白酶激活因子(apoptotic protease activating factor， Apaf)等凋亡啟動(dòng)因子釋放入胞漿。
（1)細(xì)胞色素C(cytochrome c，Cyto-C)
細(xì)胞色素C正常時(shí)位于線粒體膜間，為呼吸鏈的電子傳遞體。胞漿中新合成的細(xì)胞色素C前體沒(méi)有凋亡誘導(dǎo)作用，而當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蛩刈饔糜诰�粒體后，可引起細(xì)胞色素C釋放至胞漿，釋放入胞漿的Cyto-C在dATP存在的情況下，與Apaf-1結(jié)合,使Apaf-1暴露其上的CARD（caspase activationand recruitment domain )基序，并與procaspase-9的CARD結(jié)合形成凋亡復(fù)合體（apoptosome),導(dǎo)致procaspase-9激活,后者進(jìn)一步激活caspase-3，6等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
（2)AIF
AIF是由X染色體上單拷貝基因編碼的黃素蛋白，分子量57kd，先在胞漿中合成其前體，然后移位至線粒體，與FAD結(jié)合形成成熟的AIF，正常時(shí)位于線粒體膜間，具有NAD氧化酶的活性。在各種凋亡誘導(dǎo)因子的作用下，AIF從線粒體釋放至胞漿，然后進(jìn)入細(xì)胞核，引起染色質(zhì)濃縮靠邊，DNA斷裂成50kD的大片斷等凋亡的特征性改變。釋放入胞漿的AIF通過(guò)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而增強(qiáng)凋亡信號(hào)，并可快速激活核酸內(nèi)切酶。但與細(xì)胞色素C不同的是，AIF對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用是非Caspase依賴性的。由于AIF本身無(wú)DNA酶的活性，因此可能是它再作用于其它蛋白而引起大片斷DNA的形成。但對(duì)其作用的靶蛋白目前仍不清楚。
2.凋亡蛋白酶的活化
凋亡蛋白酶是細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”，在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用�！笆裁词堑蛲龅鞍酌�，它有一些什么特性，以及它們是如何起作用的”等等，在凋亡發(fā)生機(jī)制中再做詳細(xì)講解。
3.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶與DNA片斷化
細(xì)胞凋亡過(guò)程中執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割任務(wù)的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用于DNA雙鏈，形成高分子量的DNA片段或180-200bp整倍數(shù)的片段，在瓊脂糖凝膠電泳中呈“梯”狀(ladder pattern)條帶，這是判斷凋亡發(fā)生的客觀指標(biāo)之一。（凋亡發(fā)生機(jī)制中講解)
三、細(xì)胞凋亡與壞死的比較
細(xì)胞壞死（necrosis)通常由嚴(yán)重?fù)p傷因素（如：毒物中毒、嚴(yán)重缺血、缺氧、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)大電流等)所致，正常組織細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡作為一種生理性、主動(dòng)的細(xì)胞死亡的方式，在許多方面與壞死有顯著的差別。細(xì)胞凋亡與壞死的比較。
四、分期
細(xì)胞凋亡的過(guò)程可分為三期：①誘導(dǎo)期：凋亡誘導(dǎo)因素作用于細(xì)胞后，細(xì)胞通過(guò)復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將信號(hào)傳入胞內(nèi)，由細(xì)胞決定生存或死亡。②執(zhí)行期：決定死亡的細(xì)胞將按預(yù)定程序啟動(dòng)凋亡，激活凋亡所需的各種酶類及降解相關(guān)物質(zhì)，形成凋亡小體。③消亡期：凋亡的細(xì)胞被鄰近的細(xì)胞所吞噬并在吞噬細(xì)胞內(nèi)降解。
上述全過(guò)程需時(shí)約數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)不等。從凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到凋亡執(zhí)行的各個(gè)階段都有負(fù)調(diào)控因子存在，以形成完整的反饋環(huán)路，使凋亡過(guò)程受到精確嚴(yán)密的調(diào)控。
第二節(jié) 發(fā)生機(jī)制
一、細(xì)胞凋亡相關(guān)因素
細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，受到機(jī)體內(nèi)、外多種因素的影響，其具體的分子機(jī)制尚不完全清楚。細(xì)胞凋亡相關(guān)因素分誘導(dǎo)性因素和抑制性因素兩大類。
（一)誘導(dǎo)性因素
細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化的過(guò)程，這個(gè)程序雖已預(yù)設(shè)于活細(xì)胞之中，正常情況下它并不“隨意”啟動(dòng)，只有當(dāng)細(xì)胞受到來(lái)自細(xì)胞內(nèi)外的凋亡誘導(dǎo)因素作用時(shí)才會(huì)啟動(dòng)。因此，凋亡誘導(dǎo)因素是凋亡程序的啟動(dòng)者。在少數(shù)情況下細(xì)胞凋亡可自發(fā)產(chǎn)生，但多數(shù)是在誘導(dǎo)因素的作用下發(fā)生，常見(jiàn)誘導(dǎo)因素有：
1.激素和生長(zhǎng)因子失衡 生理水平的激素和生長(zhǎng)因子是細(xì)胞正常生長(zhǎng)不可缺少的因素，一旦缺乏，細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡；相反，某些激素或生長(zhǎng)因子過(guò)多也可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，例如：強(qiáng)烈應(yīng)激引起大量糖皮質(zhì)激素分泌，后者誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，致使淋巴細(xì)胞數(shù)量減少。
2.理化因素 射線、高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、乙醇、抗癌藥物等，均可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。例如：電離輻射可產(chǎn)生大量氧自由基，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，DNA受損，引起細(xì)胞凋亡。
3.免疫性因素 在生長(zhǎng)、分化及執(zhí)行防御、自穩(wěn)、監(jiān)視功能中，免疫細(xì)胞可釋放某些分子導(dǎo)致免疫細(xì)胞本身或靶細(xì)胞的凋亡。例如：細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（CTL)可分泌顆粒酶（granzyme)，引起靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。
4.微生物學(xué)因素 細(xì)菌、病毒等致病微生物及其毒素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如：HIV感染時(shí)，可致大量CD4+ T淋巴細(xì)胞凋亡。
5.其他 如缺血與缺氧，神經(jīng)遞質(zhì)（如谷氨酸、多巴胺)，失去基質(zhì)附著等因素都可引起細(xì)胞凋亡。在腫瘤治療中，單克隆抗體、反義寡核苷酸、抗癌藥物等均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
（二)抑制性因素
1.細(xì)胞因子 IL－2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等具有抑制凋亡的作用，當(dāng)其從細(xì)胞培養(yǎng)基中去除后，依賴它們的細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡；反之，如在培養(yǎng)體系中加入所需要的細(xì)胞因子，則可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)存活基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
2.某些激素 ACTH、睪丸酮、雌激素等對(duì)于防止靶細(xì)胞凋亡，維持其正常存活是必需的。例如：當(dāng)腺垂體被摘除或功能低下時(shí)，腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞失去ACTH刺激，可發(fā)生細(xì)胞凋亡，引起腎上腺皮質(zhì)萎縮。此時(shí)，只要給予生理維持量的ACTH即可抑制腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞的凋亡，防止腎上腺皮質(zhì)的萎縮。睪丸酮對(duì)前列腺細(xì)胞，雌激素對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞都有類似的作用。
3.其他 某些二價(jià)金屬陽(yáng)離子如Zn2+，藥物如苯巴比妥，病毒如EB病毒，以及中性氨基酸等也具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。
二、主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
大多數(shù)情況下來(lái)自于細(xì)胞外的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因素作用于細(xì)胞后要轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡信號(hào)，并通過(guò)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終激活細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩條：一為死亡受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；二為線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。下面我們分別進(jìn)行講解。
（一)死亡受體通路
一些多肽通過(guò)激活受體（如Fas,TNFR1,DR3/Wsl-1)而直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些多肽屬于腫瘤壞死因子（TNF)家族，它們與相應(yīng)的腫瘤壞死因子受體（TNFR)家族成員結(jié)合，從而在許多的細(xì)胞類型中誘導(dǎo)凋亡。其激活途徑為：配體與受體結(jié)合后，導(dǎo)致受體的三聚體化（trimerization)。使得受體的胞漿部分與接頭蛋白（adapter protein)Fas衛(wèi)生資格考試網(wǎng)-相關(guān)死亡蛋白(fas-associatedprotein with death domain, FADD)和procaspase-8結(jié)合，procaspase-8本身具有成熟的caspase-8酶的1-2%的活性，聚集后的procaspase-8通過(guò)自身或相互之間的切割產(chǎn)生成熟的caspase-8。caspase-8可激活下游的caspases-3，后者水解ICAD而活化CAD，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。caspase-8同時(shí)也激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid(binding interface database)。正常狀態(tài)下，Bid以非活性方式存在于胞漿內(nèi)，當(dāng)被caspase-8激活后，形成一種截短的Bid（truncated Bid，tBid)，后者轉(zhuǎn)移到線粒體，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等釋放入胞漿, 激活caspase-9,進(jìn)一步強(qiáng)化了caspases 級(jí)聯(lián)反應(yīng)。
（二)線粒體通路
1、線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的提出
二十世紀(jì)九十年代上半期，許多學(xué)者在研究凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞發(fā)生凋亡的形態(tài)學(xué)改變以前，線粒體即發(fā)生了某些功能改變，如氧化磷酸化脫耦聯(lián)、活性氧產(chǎn)生增多、膜電位（Δφm)消失等等，從而提出線粒體可能參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但線粒體在細(xì)胞凋亡發(fā)生機(jī)制中的重要性如何，以及它是怎樣起作用的，仍不清楚。1994年，Newmeyer等通過(guò)細(xì)胞外凋亡系統(tǒng)（cell-free system)第一次直接證明線粒體在某些細(xì)胞的凋亡中是不可缺少的。隨后Liu等于1996年發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的細(xì)胞色素C是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)分子。該研究小組又在1997年先后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞漿后，在dATP存在時(shí)與Apaf-1結(jié)合并激活Caspase-9，后者再激活Caspase-3而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。至此，細(xì)胞凋亡的線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已初步形成，在隨后的幾年中，又不斷發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的新的凋亡信號(hào)分子，并對(duì)該通路的調(diào)節(jié)機(jī)制以及分子與分子間的作用機(jī)制作了深入的研究，從而對(duì)該通路的認(rèn)識(shí)不斷豐富和完善。
2、線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
一些凋亡刺激因素如射線、化療藥物等，經(jīng)過(guò)一些目前尚未充分了解的途徑，使線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔（permeability transition pore, PTP)打開或發(fā)生其它變化，進(jìn)而促使線粒體釋放凋亡啟動(dòng)因子(Cyto-C、AIF、Apaf-1)、Smac/Diablo(second mitochondria-derived activator of caspase/directIAP-binding protein with low pI)、HtrA2(high-temperature requirement factor A2)和 procaspase-3入胞漿。上述因子通過(guò)下述多種機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡：①Cyto-C在dATP存在的情況下，與Apaf-1結(jié)合,使Apaf-1暴露其上的CARD（caspase activation and recruitment domain )基序，并與procaspase-9的CARD結(jié)合形成凋亡復(fù)合體（apoptosome),導(dǎo)致procaspase-9激活,后者進(jìn)一步激活caspase-3，6等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。②AIF通過(guò)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而增強(qiáng)凋亡信號(hào)，并可快速激活核酸內(nèi)切酶。③Smac/Diablo 和HtrA2可能通過(guò)阻斷凋亡抑制蛋白（inhibitors of apoptosis protein, IAPs)的作用參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。IAPs為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，主要抑制caspase-3,7,9而抑制細(xì)胞凋亡。
無(wú)論是在死亡受體通路還是線粒體信號(hào)通路，都存在有凋亡蛋白酶和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的活化，那么，到底什么是凋亡蛋白酶，以及他們?cè)诘蛲鲋腥绾纹鹱饔�，起什么樣的作用呢？下面我們�?lái)一一進(jìn)行學(xué)習(xí)。
3．凋亡蛋白酶
凋亡蛋白酶的激活是凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。它是一組與秀麗隱桿線蟲(Caenorhabdi-tis elegans)CED-3同源的執(zhí)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的主要蛋白酶家族。凋亡蛋白酶（caspase，是cysteine－containingaspartate-specific protease的縮寫)是一組對(duì)底物的天冬氨酸部位有特異水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。它們有兩個(gè)特征：①都是含有半胱氨酸的蛋白酶；②作用部位都在天冬氨酸殘基后的位點(diǎn)。凋亡蛋白酶前體(procaspase)可被切割為大約20kD和10kD的兩個(gè)片斷及一個(gè)N端前區(qū) (prodomain)。
至今已發(fā)現(xiàn)14種caspases，這些成員在氨基酸序列 ,空間結(jié)構(gòu)及底物特異性上均有相似性；體內(nèi)合成時(shí)均以凋亡蛋白酶前體(procaspase) (3 0 -50 ku)形式存在 ,包括三個(gè)功能區(qū) :N末端區(qū)(prodomain) ,大亞單位 (-2 0 ku) ,小亞單位 (-1 0ku) ;被激活的過(guò)程相似 ,即通過(guò)功能區(qū)間特異位點(diǎn)的蛋白酶解 ,繼而以大小亞單位形式形成異源二聚體（如圖8-14)。半胱天冬酶對(duì)底物的切割不僅特異，而且高效。
依據(jù)caspases結(jié)構(gòu)和功能的不同可分為三類：①起始凋亡蛋白酶（initiator caspases),包括具有長(zhǎng)N端前區(qū)的caspase-2,8,9,10，能對(duì)細(xì)胞凋亡的信號(hào)作出反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞的自殺過(guò)程；②效應(yīng)凋亡蛋白酶(effector caspases)：包括具有短N(yùn)端前區(qū)的caspase-3,6,7,是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的執(zhí)行者，能水解特定蛋白底物。③與炎癥有關(guān)的凋亡蛋白酶，包括caspase-1，4，5，11，12，13，14。
Caspases的分類與功能
已確定的caspase作用底物有60多個(gè)，主要有：①凋亡蛋白酶激活的DNA
酶抑制物（inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease，ICAD)：caspases水解ICAD，使凋亡蛋白酶激活的DNA酶（caspases-activateddeoxyribonuclease, CAD)處于活性狀態(tài)并使DNA片段化。②核纖層(lamina)蛋白：被caspases分解后導(dǎo)致核裂解。③細(xì)胞骨架蛋白：caspases水解細(xì)胞的骨架蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞解體，形成凋亡小體。④其它c(diǎn)aspases：在凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)（cascade)中，某些caspases可水解其它c(diǎn)aspases。如：caspase-9可使caspase-3前體水解形成具有分解蛋白質(zhì)活性的caspase-3。⑤滅活細(xì)胞凋亡的抑制物（如 Bcl-2),這不僅消除了Bcl-2蛋白的抗細(xì)胞凋亡作用，而且Bcl-2水解片段也有促細(xì)胞凋亡的作用。總之，caspases在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和完成中起重要作用，是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，決定了細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變和生物化學(xué)改變。
4.內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶
細(xì)胞凋亡過(guò)程中執(zhí)行染色質(zhì)DNA切割任務(wù)的是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，有Ca2+／Mg2+非依賴性核酸內(nèi)切酶和Ca2+／Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶。后者以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)，其激活需Ca2+／Mg2+等二價(jià)金屬離子的存在。凋亡蛋白酶激活的DNA酶（CAD)就是一種細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶。正常情況下，CAD與ICAD結(jié)合成無(wú)活性的二聚體，位于胞漿中，當(dāng)ICAD被caspase水解后，CAD與ICAD分離而被激活，從而進(jìn)入細(xì)胞核，導(dǎo)致DNA的降解。
凋亡細(xì)胞雙鏈DNA發(fā)生兩種類型的斷裂：①首先是形成高分子量的DNA片段，50kb和/或300kb，可能由染色質(zhì)中的DNA斷裂形成。②其次，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用于DNA雙鏈的核小體(nucleosome)連接部，形成180-200bp或其整倍數(shù)的片段，在瓊脂糖凝膠電泳中呈“梯”狀(ladder pattern)條帶，這是判斷凋亡發(fā)生的客觀指標(biāo)之一。
三、細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因
目前，已知細(xì)胞凋亡相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種，根據(jù)功能的不同可將其分為三類：抑制凋亡基因、促進(jìn)凋亡基因和雙向調(diào)控基因。
• 抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP
促進(jìn)凋亡基因：wtp53，Bax
雙向調(diào)控基因：c-myc，Bcl-xbcl-2家族分子
下面我們重點(diǎn)學(xué)習(xí)幾種：
1.Bcl-2
Bcl-2（B cell lymphoma/leukemia-2)因其首先在B細(xì)胞淋巴瘤中分離出來(lái)而得名，是一種細(xì)胞原癌基因產(chǎn)物，在進(jìn)化上保守，如線蟲的CED-9就與Bcl-2同源，結(jié)構(gòu)與功能都很相似。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)16個(gè)家族成員，其中抗凋亡成員有Bcl-2，Bcl-XL， bcl-w、A1/Bf1-1、Nr13、mcl-1等，它們由4個(gè)短的保守的BH（Bcl-2homology)結(jié)構(gòu)域（BH1-BH4)組成，還含有一個(gè)羧基端的疏水尾巴。它們大多數(shù)情況下附著在線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，此時(shí)其疏水尾巴向著胞漿側(cè)。而促凋亡成員主要有bax、Bik、Bad、bid、Hrk、bcl-Xs、bim、mtd等，它們或者缺乏BH4結(jié)構(gòu)域，或者只含有BH3結(jié)構(gòu)域。
Bcl-2許多家族成員不但可形成同源二聚體，同時(shí)促凋亡與抗凋亡成員間還可形成異源二聚體。 因此Bcl-2家族成員對(duì)凋亡的控制主要取決于其抗凋亡與促凋亡成員間量的對(duì)比，此外磷酸化等蛋白修飾也與其調(diào)節(jié)凋亡有關(guān)。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2associated X protein， Bax)首先因與bcl-2形成異源二聚體而被發(fā)現(xiàn)。Bax具有孔形成能力，并能誘導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase-9，啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Bcl-2能抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡�，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，Bcl-2家族中抑制凋亡因子與促進(jìn)凋亡因子的比例決定細(xì)胞的命運(yùn)。
Bcl-2是第一個(gè)被確認(rèn)有抑制凋亡作用的基因。人的Bcl-2蛋白是由229個(gè)氨基酸組成的膜蛋白，主要分布在線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜等處。廣泛存在于造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及多種癌細(xì)胞。bcl-2的高表達(dá)能阻抑多種凋亡誘導(dǎo)因素（如糖皮質(zhì)激素、射線照射、fo波酯等)所引發(fā)的細(xì)胞凋亡。
Bcl-2抗凋亡機(jī)制與線粒體功能有關(guān)。Bcl-2的其中一個(gè)功能為形成離子通道，它的高表達(dá)維持了線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，阻止了線粒體膜電位的下降和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制線粒體促凋亡的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF)等的釋放，從而防止細(xì)胞凋亡發(fā)生。此外，Bcl-2能結(jié)合Apaf-1和caspase 9，并維持其非活化狀態(tài)，阻止caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，防止細(xì)胞凋亡。
BcL-2抗凋亡機(jī)制：
①直接的抗氧化;②抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì);③抑制促凋亡的Bax，Bak細(xì)胞毒作用;④抑制Caspases激活;⑤維持細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài).
2. Fas
Fas 屬腫瘤壞死因子受體（TNFR)家族成員， Fas配體（FasL)屬TNF家族成員。 Fas是跨膜蛋白，由胞外區(qū)(157aa)，穿膜區(qū)(17 aa)及胞漿區(qū)(145 aa)組成。Fas胞漿區(qū)一段60～70氨基酸序列與TNFR胞漿區(qū)高度同源，并介導(dǎo)細(xì)胞死亡，稱之為死亡域(death domain，DD)。 Fas較廣泛地分布于多種類型的細(xì)胞。 FasL與其受體Fas結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
3．p53基因
野生型p53基因編碼的p53蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有促進(jìn)作用。，該蛋白是一種DNA結(jié)合蛋白，具有轉(zhuǎn)錄激活作用。野生型p53蛋白在細(xì)胞周期G1期發(fā)揮檢查點(diǎn)的作用，如發(fā)現(xiàn)有缺陷的DNA，它就阻止細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，并啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制，如修復(fù)失敗則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制。p53蛋白的這一功能使那些遺傳信息出錯(cuò)，有可能演變?yōu)閻盒阅[瘤的細(xì)胞被消滅在萌芽之中，因而被稱為“分子警察”。bax基因首先被發(fā)現(xiàn)可由p53誘導(dǎo)，其它被p53誘導(dǎo)參與細(xì)胞凋亡的基因有：fas、DR5(Killer/Death Receptor 5)、PAG608(p53-activatedgene 608)、p21、mdm2及Apaf-1等。圖8-19 p53蛋白的分子警察功能
突變型p53(mtp53)基因編碼的P53蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用。人類腫瘤一半以上具有p53基因突變和缺失。
p53蛋白的N端也可不通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活作用直接參與腫瘤的生長(zhǎng)抑制�？傊琾53在不同的細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可以不同，但p53依賴的細(xì)胞凋亡最終可能都是通過(guò)導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，caspases的激活而完成。
4.c-myc基因
原癌基因c-myc家族被認(rèn)為與人類多種惡性疾病的發(fā)生有關(guān)。myc蛋白作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，既可激活介導(dǎo)細(xì)胞增殖的基因，也可激活介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，具有雙向調(diào)節(jié)作用。決定細(xì)胞增殖或凋亡，取決于細(xì)胞接受何種信號(hào)以及細(xì)胞所處的生長(zhǎng)環(huán)境。例如：在c-myc基因表達(dá)后，如果沒(méi)有足夠的生長(zhǎng)因子持續(xù)作用，細(xì)胞就發(fā)生凋亡；反之，細(xì)胞就處于增殖狀態(tài)。
5.IAP家族
凋亡抑制蛋白IAP家族是一組具有BIR（baculoviral IAP repeat)結(jié)構(gòu)域和抑制細(xì)胞凋亡的蛋白。很多真核細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有IAP家族成員。IAP家族蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域是其抑制細(xì)胞凋亡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，只要具有BIR結(jié)構(gòu)域，IAP家族蛋白就具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。在人類已確認(rèn)有6種IAP相關(guān)蛋白，這些蛋白的過(guò)度表達(dá)，都可以不同程度地抑制多種因素引起的細(xì)胞凋亡。在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，IAP家族蛋白能通過(guò)抑制caspase-3，7，9等的活性抑制細(xì)胞凋亡。
6.其他基因
jun、fos、myb、asy、Rb等基因都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。
細(xì)胞凋亡是一個(gè)重要的生物學(xué)過(guò)程，對(duì)多細(xì)胞生物的完整性，體內(nèi)平衡以及腫瘤的發(fā)生均有重要的生物學(xué)意義。許多的基因相互協(xié)調(diào)，共同參與了細(xì)胞凋亡精細(xì)調(diào)控。
第三節(jié) 細(xì)胞凋亡與疾病
一、細(xì)胞凋亡的生理意義
細(xì)胞凋亡在機(jī)體的一生中，從受精至成熟、老化等各個(gè)方面都發(fā)揮重要作用。
(一)確保正常生長(zhǎng)發(fā)育。
例如：人胚胎肢芽發(fā)育過(guò)程中的指（趾)間組織通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制而被逐漸消除，形成指（趾)間隙。
(二)維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
細(xì)胞凋亡參與了正常成年組織細(xì)胞更新（如上皮組織、血細(xì)胞的更新，衰老細(xì)胞的清除)、生理器官的內(nèi)分泌調(diào)控（如子宮產(chǎn)后復(fù)原，月經(jīng)期子宮內(nèi)膜的脫落)以及對(duì)受損不能修復(fù)的細(xì)胞或突變細(xì)胞的清除等重要生理過(guò)程。
(三)發(fā)揮積極的防御功能。
當(dāng)機(jī)體受到病原微生物感染時(shí)，宿主細(xì)胞發(fā)生主動(dòng)凋亡，導(dǎo)致被感染細(xì)胞的死亡和微生物的清除。
二、 細(xì)胞凋亡與疾病發(fā)生的關(guān)系
細(xì)胞凋亡調(diào)控異�？蓪�(dǎo)致多種疾病的發(fā)生。細(xì)胞凋亡與疾病的關(guān)系—— 該“死”的細(xì)胞不死，不該“死”的細(xì)胞卻死了，也就是說(shuō)無(wú)論凋亡過(guò)度或凋亡不足都可以導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
下面我們具體討論細(xì)胞凋亡與幾種常見(jiàn)疾病發(fā)生的關(guān)系
(一) 細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生中的作用
目前認(rèn)為細(xì)胞增殖和分化異常是腫瘤發(fā)病的途徑之一，而凋亡受抑、細(xì)胞死亡不足是腫瘤發(fā)病的另一途徑。許多人類惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)生理刺激做出凋亡反應(yīng)的能力顯著下降。p53突變，Bcl-2的高表達(dá)在許多腫瘤中都存在。
(二) 細(xì)胞凋亡在缺血性心臟病及心衰發(fā)病機(jī)制中的作用
心肌細(xì)胞雖為終末分化細(xì)胞，但仍存在凋亡在心肌梗死、I/R損傷及慢性心衰等心臟疾病的動(dòng)物模型及臨床病人均觀察到細(xì)胞凋亡的存在。這是一梗死的心肌，將梗死區(qū)邊緣的心肌做成切片后，可發(fā)現(xiàn)有凋亡細(xì)胞。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明caspase抑制劑，缺血預(yù)適應(yīng)可減少心肌細(xì)胞凋亡，縮小梗塞范圍，改善心功能。
（三)細(xì)胞凋亡在其它疾病發(fā)生中的作用
1．神經(jīng)元退行性病變
在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中有一類以特定神經(jīng)元進(jìn)行性喪失為其病理特征的疾病，如阿爾茨海默氏病，帕金森氏病。現(xiàn)在研究表明，造成神經(jīng)元喪失的主要機(jī)制是細(xì)胞凋亡。由于大量神經(jīng)元發(fā)生凋亡，大腦皮質(zhì)出現(xiàn)廣泛萎縮，腦溝變寬，腦回變窄。
2．自身免疫性疾病
正常情況下，免疫系統(tǒng)在發(fā)育過(guò)程中已將針對(duì)自身抗原的免疫細(xì)胞以細(xì)胞凋亡的方式有效清除。如清除失敗，針對(duì)自身抗原的T細(xì)胞就可存活，進(jìn)而攻擊自身組織，產(chǎn)生自身免疫性疾病。
3．病毒感染
如人免疫缺陷病毒（HIV)感染引起的AIDS，其關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制是CD4+淋巴細(xì)胞被選擇破壞。研究表明，細(xì)胞凋亡在AIDS CD4+淋巴細(xì)胞減少中扮演了非常重要的角色。
4．創(chuàng)傷合并休克，肝衰，免疫排斥反應(yīng)等等
第四節(jié) 凋亡在疾病防治中的意義（自學(xué))
細(xì)胞凋亡是一個(gè)程序化過(guò)程，可以通過(guò)不同的手段在不同的階段進(jìn)行干預(yù)而治療疾病
一．合理利用凋亡相關(guān)因素
（一)誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡
某些生長(zhǎng)因子或激素是細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的，一旦撤除細(xì)胞即可發(fā)生凋亡。
（二)減少細(xì)胞凋亡
IL－2、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等具有抑制凋亡的作用。
二．干預(yù)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
可利用阿霉素刺激腫瘤細(xì)胞在其膜上表達(dá)Fas/FasL，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
三．調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因
運(yùn)用分子生物學(xué)手段人為地控制凋亡相關(guān)基因（P53，Bcl-2)的表達(dá)，便有可能控制凋亡過(guò)程。
四．控制凋亡相關(guān)的酶
在凋亡執(zhí)行階段，核酸內(nèi)切酶和caspases在摧毀細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面起著關(guān)鍵性作用，因此若能控制他們的活性。細(xì)胞凋亡過(guò)程必然受到控制。
五．防止線粒體跨膜電位的下降
線粒體跨膜電位就可以防止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。目前已發(fā)現(xiàn)環(huán)胞霉素A可抑制線粒體跨膜電位的下降，并因此而防止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
Summary：
Apoptosis,also known as programmed cell death, is the factor that induced in vitro and invivo, by the strict control of the autonomy and orderly cell death. The wholeprocess is divided into induction period, and the demise of the implementationperiod. Cells in hormones, growth factors, physical and chemical factors,immune factors, factors such as the role of microbiology, gene regulation bythe death of the death signal transduction pathway, activation of caspases upstream and downstream of the initial effects of caspases and related enzymes, cells characteristicbiochemical and morphological changes. If mitochondria in apoptosis initiationfactor (Cyto-C, AIF, Apaf)released into the cytoplasm; DNA fragmentation (or a 180-200 bp fragment of the whole multiples), agarosegel electrophoresis in a "ladder "-shaped strip; cell shrinkage,vacuolar membrane of the nuclear chromatin condensation, while poly, poly andnuclear debris; formation of apoptotic bodies. After the formation of apoptoticbodies may be nearby macrophage recognition, swallowed and digested. The entireprocess of apoptosis no leakage of contents, without local inflammatoryreaction. Abnormal regulation of apoptosis can lead to various diseases, suchas lack of apoptosis in tumor is easy, autoimmune diseases, however heartfailure, myocardial ischemia and ischemic - reperfusion injury, neuronaldegenerative diseases, transplant rejection remain with the excessiveapoptosis.
復(fù)習(xí)思考題:
1、試述細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的概念、差別以及生理病理意義。
2、試述細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞的主要形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化。
3、試述線粒體啟動(dòng)因子的功能和生物學(xué)意義。
4、試述內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和凋亡蛋白酶的種類、理化特性以及生物學(xué)意義。
5、試述凋亡相關(guān)基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。
6、試述線粒體通路及死亡受體通路在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用及其聯(lián)系。
主要參考文獻(xiàn)
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