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【摘要】目的：觀察PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因)對人乳腺癌細胞ZR751細胞增殖和細胞周期的影響。方法：利用脂質(zhì)體介導法將攜帶有野生型和突變型PTEN cDNA的真核表達載體pBPwtPTEN和pBPG129RPTEN導入人乳腺癌ZR751細胞（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后實驗分為CWTPTEN組、CG129RPTEN組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組即對照組)后，以RTPCR、Western blot 分析目的基因的表達，并采用MTT法和流式細胞術(shù)檢測細胞增殖和細胞周期。 結(jié)果：CWTPTEN組、CG129RPTEN組細胞PTEN mRNA 及PTEN蛋白出現(xiàn)明顯的高表達。CWTPTEN組細胞生長的抑制率可高達42.7%，與對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)。但CG129RPTEN組細胞生長的抑制率與對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)。流式細胞術(shù)顯示CWTPTEN組細胞周期從G1期到S期已發(fā)生抑制。結(jié)論：野生型PTEN可依賴其磷酸酶活性抑制腫瘤細胞的增殖，并最終誘導細胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】 人乳腺癌ZR751細胞； PTEN基因；細胞周期
【Abstract】 Objective: To investigate the effect of the PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten) gene on cell cycle and proliferation in human breast cancer cell line ZR751. Methods: The eukaryotic expression vector pBPwtPTEN and pBPG129RPTEN containing PTEN cDNA was transfected into ZR751 cells by lipofectamine. Three groups were set: CWTPTEN, CG129RPTEN and cells without transfection as the control group. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Westernblot methods were used to detect PTEN expression in the transfected ZR751 cells. The cell cycle, cell proliferation and cell apoptosis of the ZR751 cells was determined by the MTT and flow cytometry. Results: High expression of PTEN mRNA and protein was seen in the transfected ZR751 cells. The proliferation of CWTPTEN cells were inhibited by 42.7% (vs the control group, P< 0.05), while CG129RPTEN cells showed no significant change in proliferation (vs the control group, P> 0.05). The cell cycle from G1 to S of CWTPTEN cells was inhibited. Conclusion: Wide type PTEN gene might suppress the growth and induces the apoptosis in human breast cancer cell line ZR751 cells through its phosphatase activity.
【Key words】 ZR751; PTEN; cell cycle; proliferation
PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10號染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因)是繼p53基因之后新近發(fā)現(xiàn)的與各種腫瘤密切相關(guān)的一個抑癌基因，其突變與缺失見于多種惡性腫瘤，如前列腺癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等。目前發(fā)現(xiàn)PTEN是唯一一個編碼具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因［1］，因其憑借磷酸酶活性負調(diào)控PI3K/Akt信號傳導途徑而備受關(guān)注。雖有研究表明，PTEN的缺失與突變與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］，然而目前有關(guān)PTEN基因?qū)θ橄侔┘毎L抑制的作用多集中在對乳腺癌組織的研究，而PTEN基因轉(zhuǎn)染對人乳腺癌細胞的研究不多。本實驗以外源性PTEN基因?qū)朐摶騼?nèi)源性缺失的乳腺癌細胞ZR751中，通過RTPCR、Western blot 分析目的基因的表達；同時采用MTT法和流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后PTEN基因?qū)R751細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響，以探討其在乳腺癌細胞株生長抑制過程中的作用機制。
1 材料與方法
1．1 材料
人乳腺癌細胞株ZR751由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所提供。pBPwtPTEN及pBPG129RPTEN質(zhì)粒由美國加州大學Ludwig癌癥研究所Furnari教授惠贈。胰蛋白酶為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青微生物材料工程公司產(chǎn)品。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，嘌呤霉素、DNA Ladder 、DEPC、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等購自美國Sigma公司。RTPCR反應試劑盒購自QIAGEN公司。小鼠抗人PTEN單克隆抗體、山羊抗人Actin多克隆抗體、EXL發(fā)光試劑盒購自Santa Cruz 生物技術(shù)公司。HRP標記山羊抗小鼠IgG、 HRP標記馬抗山羊IgG等其它試劑購自北京中山生物技術(shù)有限公司等國內(nèi)公司。PTEN、GAPDH引物由上海生工公司合成。
1．2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) ZR751細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為15%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)液中，同時細胞培養(yǎng)液加入0.5 U/mL胰島素，并將細胞于37 ℃、體積分數(shù)為5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，經(jīng)過消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine 2000說明書分別將編碼人野生型PTEN的真核表達質(zhì)粒pBP wtPTEN和突變型PTEN質(zhì)粒pBPG129RPTEN轉(zhuǎn)染對數(shù)生長期的ZR751細胞，以1.5 mg/L嘌呤霉素持續(xù)篩選3周，挑選陽性細胞克隆，擴增培養(yǎng)。分別將成功轉(zhuǎn)染pBP wtPTEN和pBPG129RPTEN質(zhì)粒的ZR751細胞命名為CWTPTEN細胞和CG129RPTEN細胞，稱為CWTPTEN組和CG129RPTEN組。未轉(zhuǎn)染的ZR751細胞作陰性對照稱為對照組。
1.2.3 RTPCR法檢測轉(zhuǎn)染前后PTEN基因的表達 用質(zhì)量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶消化，收集培養(yǎng)CWTPTEN、CG129RPTEN和ZR751細胞。制成懸浮液并計算細胞數(shù)，每個樣本收集等量細胞（3.0×106)，用Trizol等試劑分別提取CWTPTEN細胞、CG129RPTEN細胞和ZR751細胞中的總RNA，總RNA沉淀溶解于DEPC處理過的無RNase的三蒸水中。采用RTPCR反應試劑盒鑒定各轉(zhuǎn)染細胞PTEN mRNA的表達，利用引物合成軟件Premier 5和oligo 6自我設(shè)計PTEN（373bp)引物序列為：PTEN/ sense primer: 5’ aaa gct gga aag gga cga ac 3’；PTEN/antisense primer: 5’ cag gta acg gct gag gga ac 3’ ； GAPDH/sense primer: 5’ gaa ggt gaa ggt cgg agt c 3’；GAPDH/antisense primer: 5’ gaa gat ggt gat ggg att tc 3’ 。RTPCR反應體系：50 ℃ 30 min(RT反應)，95 ℃ 15min（預變性)，94 ℃ 45sec（變性)，55 ℃ 1min（退火)，72 ℃ 1min（延伸)，共30個循環(huán)，72 ℃ 10min（后延伸)；PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，圖像分析軟件BandScan 4.3進行光密度積分值分析，計算出PTEN mRNA與內(nèi)參照GAPDH mRNA的光密度積分值比作為PTEN mRNA的相對含量值。
1.2.4 Westernblot檢測PTEN蛋白的表達 用0.25%胰蛋白酶消化，收集培養(yǎng)CWTPTEN細胞、CG129RPTEN細胞和ZR751細胞。制成懸浮液并計算細胞數(shù)，每個樣本收集等量細胞（5.0×106)，加入細胞裂解液，提取蛋白質(zhì)，以質(zhì)量分數(shù)10%聚聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜（PVDF)上，硝酸纖維膜上加入質(zhì)量分數(shù)10%脫脂奶粉封閉后，加入一抗工作液（小鼠抗人PTEN單克隆抗體，工作濃度為1∶300)，4 ℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶4 000)，ECL發(fā)光試劑進行顯像后拍照，圖像經(jīng)掃描儀掃描后，用Scion Image圖像分析軟件進行光密度積分值(Integral of optical density，IOD)分析，計算出各目的蛋白表達量與內(nèi)參照GAPDH 蛋白表達量的光密度積分值之比作為目的蛋白表達量的相對含量值。每個圖像均重復分析3次，取平均值。
1.2.5 MTT法檢測不同PTEN表達質(zhì)粒對細胞的增殖況 分別取CWTPTEN細胞、CG129RPTEN細胞和ZR751細胞在含15%FCS的RPMI1640培養(yǎng)中培養(yǎng)48h后，加入10 mg/mL MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，在加入100μL /孔的DMSO，取出后，用酶標儀測定吸光度A570 nm，結(jié)果取3個平行孔的均值，重復3次實驗。腫瘤細胞的存活率（%)=（各組A570 nm/陰性對照組A570 nm)×100%。細胞抑制率（%)=1（各組A570 nm/陰性對照組A570 nm)×100%。
1.2.6 流式細胞術(shù) 分別取CWTPTEN細胞、CG129RPTEN細胞和ZR751細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，冷磷酸緩沖液（PBS)洗滌后離心，用體積分數(shù)為70%的4 ℃預冷乙醇固定過夜后，離心收集細胞，用PBS洗3次去除乙醇，細胞團重懸于PBS中，用20μg/mL含RNase A的碘化丙啶（PI)染色液避光染色30 min，經(jīng)100目尼龍網(wǎng)過濾后進行FCM（flow cytometry， 流式細胞術(shù))檢測。
1.2.7 統(tǒng)計學處理 實驗計量資料用±s表示，使用SAS 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計描述。行單因素方差分析和q檢驗，兩組抑制率比較行t檢驗。
2 結(jié)果
2.1 PTEN基因成功轉(zhuǎn)染
采用脂質(zhì)體介導法，將質(zhì)粒pBPwtPTEN和pBPG129RPTEN轉(zhuǎn)染入ZR751人乳腺癌細胞中，經(jīng)嘌呤霉素持續(xù)篩選，獲得陽性轉(zhuǎn)染的細胞克隆。
2.2 RTPCR檢測PTEN mRNA 的表達水平
紫外燈下可見，CWTPTEN細胞和CG129RPTEN細胞373bp 處有清晰明亮的條帶，而ZR751細胞373bp處條帶模糊，3組細胞泳道在226bp 處均出現(xiàn)明亮的條帶(見圖1)。論文客服QQ，81995535說明ZR751細胞PTEN mRNA 只有少量表達，而CWTPTEN組和CG129RPTEN組細胞中PTEN mRNA出現(xiàn)高表達。
M：100 bp DNA marker; A: ZR751細胞；B：CG129RPTEN細胞；C：CWTPTEN細胞
圖1 轉(zhuǎn)染PTEN前后PTEN mRNA 的表達
2.3 Western bolt檢測PTEN 蛋白的表達水平
由圖2可見， CWTPTEN細胞和CG129RPTEN細胞具有明顯的PTEN蛋白條帶，而ZR751細胞PTEN蛋白條帶不明顯，結(jié)果說明，ZR751細胞PTEN蛋白表達水平非常低，而轉(zhuǎn)染后PTEN蛋白水平出現(xiàn)高表達。 A: ZR751細胞；B：CG129RPTEN細胞；C：CWTPTEN細胞
圖2 轉(zhuǎn)染PTEN前后PTEN蛋白的表達
2.4 不同表達質(zhì)粒抑制腫瘤細胞增殖情況
CWTPTEN組與對照組比較，細胞增殖明顯受到抑制（抑制率為42.7%，(P<0.05))；而CG129RPTEN組細胞增殖與對照組比較差異無顯著性（P>0.05)，見表1。表1 突變型與野生型PTEN質(zhì)粒對ZR751細胞增殖的影響 2.5 外源性PTEN對ZR751細胞生長周期的影響
流式細胞儀檢測細胞周期顯示, CWTPTEN組與對照組比較，G1期細胞數(shù)由54.52%增加到63.17%，S期細胞數(shù)由36.51%變?yōu)?1.15%，提示從G1期到S期發(fā)生抑制。而CG129RPTEN組與對照組比較，差異無顯著性（P>0.05)，見表2。表2 外源性PTEN對ZR751細胞周期的影響
3 討論
癌基因的激活和抑癌基因的失活，是目前較為公認的腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因（如p53、p16、p21等)在腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中存在有缺失、突變或異常低表達等改變，且表達量隨腫瘤惡性程度的增高而降低［4］。PTEN基因自發(fā)現(xiàn)并克隆以來作為一種與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學特性密切相關(guān)的抑癌基因已成為當前研究的熱點。PTEN編碼403個氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)［5］，其氨基端（1~185)是活性中心，含有一個雙重底物特異磷酸酶的結(jié)構(gòu)域，即具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶的活性。前者可使酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸的殘基脫磷酸化，在多種途徑和細胞周期中發(fā)揮作用。PTEN蛋白還可憑借其脂質(zhì)磷酸酶活性，特異地使磷脂酰肌醇三磷酸（PtdIns(3,4,5)P3)的3’磷酸脫去［6］，使PtdIns(3,4,5)P3轉(zhuǎn)變?yōu)镻tdIns(4,5)P2，調(diào)節(jié)第二信使PtdIns(3,4,5)P3的水平，抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導途徑，導致細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞生長周期的阻滯，進而調(diào)控細胞的生長，并最終誘導細胞凋亡［7］。
本實驗所用的野生型PTEN表達質(zhì)粒pBPwtPTEN和磷酸酶活性缺失型PTEN表達質(zhì)粒pBPG129RPTEN都是將全長為1212bp的人PTEN基因的cDNA連接到pBP載體上構(gòu)建而成，兩者的區(qū)別在于，pBPwtPTEN質(zhì)粒中連接的是具有磷酸酶活性的野生型PTEN基因，而pBPG129RPTEN質(zhì)粒中的PTEN基因是突變型基因，此基因因其磷酸酶活性的C124位點發(fā)生點突變而致其失去脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。Western blot檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pBPwtPTEN質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染pBPG129RPTEN質(zhì)粒組的細胞均出現(xiàn)有PTEN產(chǎn)物蛋白的高表達，其表達水平與對照組相比，差異有顯著性（P<0.05),說明兩種PTEN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到人乳腺癌細胞ZR751均能提高PTEN 蛋白的表達水平。RTPCR結(jié)果進一步證實了兩種表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞ZR751后，能有效地提高PTEN mRNA的表達，進而促進PTEN蛋白的高表達。此外，在細胞增殖方面，本文結(jié)果顯示：CWTPTEN組與CG129RPTEN組、對照組比較，差異均有顯著性；另外，我們還對質(zhì)�？蛰d細胞增殖作過觀察，其結(jié)果與ZR751組比較差異無顯著性［8］。從而排除了載體對細胞的毒副作用，表明轉(zhuǎn)染野生型PTEN基因是抑制腫瘤細胞生長的主要原因。流式細胞術(shù)的結(jié)果表明，PTEN轉(zhuǎn)染組細胞增殖停滯于G1期，并且細胞凋亡明顯增加。說明PTEN促進腫瘤細胞凋亡是其抑癌機制之一。
我們在采用野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染的同時，以突變型PTEN基因作對照，后者的突變位于磷酸酶活性中心并使其失去磷酸酶活性。結(jié)果顯示，野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染具有抑制腫瘤細胞生長、促進細胞凋亡及引起細胞周期發(fā)生阻滯的作用。醫(yī)學全在,線m.payment-defi.com而突變型PTEN基因轉(zhuǎn)染則沒有這樣的作用，說明PTEN基因磷酸酶活性的缺陷可能是引起功能差異的主要原因，故認為PTEN的抑癌作用與磷酸酶活性有關(guān)。
以上結(jié)果顯示，PTEN基因可能通過PI3K/Akt途徑使ZR751乳腺癌細胞發(fā)生細胞周期的改變、抑制其體外增殖。這似乎為乳腺癌的基因治療提供了新的思路。
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