公開(kāi)(公告)號(hào)
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CN100335628C
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公開(kāi)(公告)日
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2007.09.05
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申請(qǐng)(專(zhuān)利)號(hào)
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CN200510025775.5
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申請(qǐng)日期
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2005.05.12
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專(zhuān)利名稱
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分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗及其構(gòu)建方法
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主分類(lèi)號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I
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分類(lèi)號(hào)
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C12N15/09(2006.01)I;C12N15/21(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12Q1/68(2006.01)I;C07H21/00(2006.01)I;A61K38/21(2006.01)I;A61K39/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人
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上海交通大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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劉海濤;夏術(shù)階;孫曉文
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地址
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200240上海市閔行區(qū)東川路800號(hào)
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頒證日
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國(guó)際申請(qǐng)
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進(jìn)入國(guó)家日期
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專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu)
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上海交達(dá)專(zhuān)利事務(wù)所
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代理人
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毛翠瑩
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國(guó)省代碼
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上海;31
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主權(quán)項(xiàng)
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一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構(gòu)建方法,其特征在于包括如下步驟:1)卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建:分別設(shè)計(jì)編碼Ag85B信號(hào)肽的基因片段和IFN-α2a的擴(kuò)增引物,編碼Ag85B信號(hào)肽的基因片段的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcoRI,IFN-α2a的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcoRI和SalI,經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成編碼Ag85B信號(hào)肽的基因片段和IFN-α2a基因片段,將編碼Ag85B信號(hào)肽的基因片段克隆到pMV261載體中,得到pMS,再將IFN-α2a基因片段與pMS載體編碼Ag85B信號(hào)肽的基因片段連接,得到穿梭表達(dá)載體pMSIFN-α2a;2)卡介苗的培養(yǎng):選取卡介苗為上海丹麥株,將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng),液體培養(yǎng)基含有10%的營(yíng)養(yǎng)劑ADC、0.5%吐溫80和0.2%甘油,搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分,三周后卡介苗處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,OD600值=0.6,制得感受態(tài)卡介苗;3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGIFN-α2a:在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)載體pMSIFN-α2a,置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽(yáng)性重組子,電轉(zhuǎn)參數(shù):電壓為2500V,電容為25μF,電阻為1000Ω,陽(yáng)性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選,培養(yǎng)兩周后得到陽(yáng)性克隆rBCGIFN-α2a,然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長(zhǎng),大量培養(yǎng);4)重組卡介苗rBCGIFN-α2a的鑒定與功能檢測(cè):進(jìn)行抗酸染色初步確定rBCGIFN-α2a為抗酸桿菌,抽提rBCGIFN-α2a質(zhì)粒DNA后,PCR擴(kuò)增得到IFN-α2a的基因片段,WesternBlot檢測(cè)到rBCGIFN-α2a培養(yǎng)上清中和菌體中有IFN-α2a蛋白的表達(dá),ELISA方法檢測(cè)到rBCGIFN-α2a培養(yǎng)上清中有高含量的IFN-α2a。
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摘要
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本發(fā)明涉及一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗及其構(gòu)建方法,利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號(hào)肽片段和人IFN-α2a的基因克隆至pMV261,得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIFN-α2a,然后采用電穿孔技術(shù)將pMSIFN-α2a導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGIFN-α2a,依靠pMSIFN-α2a在BCG的復(fù)制和信號(hào)肽的分泌作用,能夠高效分泌IFN-α2a。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGIFN-α2a具有BCG和IFN-α2a的雙重效果,能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤;利用重組卡介苗rBCGIFN-α2a在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用IFN-α2a的用量,可以克服BCG治療的毒副作用。
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國(guó)際公布
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