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檢測堿性鞘磷脂酶的分析方法以及用于該方法的試劑盒

公開(公告)號 CN1608138A  
公開(公告)日 2005.04.20  
申請(專利)號 CN02825879.7  
申請日期 2002.12.19  
專利名稱 檢測堿性鞘磷脂酶的分析方法以及用于該方法的試劑盒  
主分類號 C12Q1/44  
分類號 C12Q1/44;G01N33/574  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權 2001.12.21 IE 011100  
申請(專利權)人 艾蒂爾藥物有限公司  
發(fā)明(設計)人 C·德西蒙  
地址 葡萄牙豐沙爾  
頒證日  
國際申請 PCT/IT2002/000811 2002.12.19  
進入國家日期 2004.06.21  
專利代理機構 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務所  
代理人 程泳  
國省代碼 葡萄牙;PT  
主權項 一種檢測患者糞便中的堿性鞘磷脂酶的方法,包括以下步驟:1)收集患者的糞便樣品并使其干燥;2)稱取大約3-4克干燥樣品,并懸浮于20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4并且pH值為7.4的勻漿緩沖液中;3)在+4℃,4000rpm下離心樣品60分鐘;4)回收上清液,再在+4℃,4000rpm下離心15分鐘;5)應用PierceProteinAssay測定上清液中的蛋白含量,使用牛血白蛋白作為標準參照,對于每個樣品,所用的蛋白濃度在32mg/ml-40mg/ml之間,吸取25μl各樣品至孔中;6)向各25μl樣品加入65μl包含50mMTris/HCl、2mMEDTA、0.15MNaCl的pH值為9.0的檢測緩沖液和10μl29μM的鞘磷脂,并向檢測緩沖液中加入3mM濃度的膽鹽(TC、TDC、GC、GCDC);7)在37℃下孵育1小時;8)吸取每種冷凍干燥的細菌鞘磷脂酶標準參照100μl和10μl神經(jīng)鞘磷脂(29μM),與樣品一樣在37℃下孵育1小時;9)1小時后,加入100μl包含50mM的pH值為7.4的Tris/HCl、10mMβ-磷酸甘油、750μMATP、5mMEDTA、5mMEGTA、100μM的AmplexRed、8U/ml堿性磷酸酶、0.2U/ml膽堿化酶、2U/ml辣根過氧化酶的反應緩沖液;10)在避光條件下于37℃孵育反應物1小時或更長時間;11)用熒光微板讀取器檢測熒光,其中激發(fā)波長為530-560nm,并在590nm處檢測發(fā)射光;12)對每一個值,通過減去非鞘磷脂酶對照的值來對背景熒光進行校正。  
摘要 本發(fā)明披露了一種熒光分析方法及用于該方法的檢測試劑盒,該方法用于檢測需要此種檢測的患者糞便中的堿性鞘磷脂酶(SMase),因為堿性SMase是重癥病理狀態(tài),如結腸癌的標記物。  
國際公布 WO2003/056031 英 2003.7.10  
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