| 公開(公告)號 | CN1608138A |
| 公開(公告)日 | 2005.04.20 |
| 申請(專利)號 | CN02825879.7 |
| 申請日期 | 2002.12.19 |
| 專利名稱 | 檢測堿性鞘磷脂酶的分析方法以及用于該方法的試劑盒 |
| 主分類號 | C12Q1/44 |
| 分類號 | C12Q1/44;G01N33/574 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權 | 2001.12.21 IE 011100 |
| 申請(專利權)人 | 艾蒂爾藥物有限公司 |
| 發(fā)明(設計)人 | C·德西蒙 |
| 地址 | 葡萄牙豐沙爾 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | PCT/IT2002/000811 2002.12.19 |
| 進入國家日期 | 2004.06.21 |
| 專利代理機構 | 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務所 |
| 代理人 | 程泳 |
| 國省代碼 | 葡萄牙;PT |
| 主權項 | 一種檢測患者糞便中的堿性鞘磷脂酶的方法，包括以下步驟：1)收集患者的糞便樣品并使其干燥；2)稱取大約3-4克干燥樣品，并懸浮于20ml包含0.25M蔗糖、0.15M的KCl、50mM的KH2PO4并且pH值為7.4的勻漿緩沖液中；3)在+4℃，4000rpm下離心樣品60分鐘；4)回收上清液，再在+4℃，4000rpm下離心15分鐘；5)應用PierceProteinAssay測定上清液中的蛋白含量，使用牛血清白蛋白作為標準參照，對于每個樣品，所用的蛋白濃度在32mg/ml-40mg/ml之間，吸取25μl各樣品至孔中；6)向各25μl樣品加入65μl包含50mMTris/HCl、2mMEDTA、0.15MNaCl的pH值為9.0的檢測緩沖液和10μl29μM的鞘磷脂，并向檢測緩沖液中加入3mM濃度的膽鹽(TC、TDC、GC、GCDC)；7)在37℃下孵育1小時；8)吸取每種冷凍干燥的細菌鞘磷脂酶標準參照100μl和10μl神經(jīng)鞘磷脂(29μM)，與樣品一樣在37℃下孵育1小時；9)1小時后，加入100μl包含50mM的pH值為7.4的Tris/HCl、10mMβ-磷酸甘油、750μMATP、5mMEDTA、5mMEGTA、100μM的AmplexRed、8U/ml堿性磷酸酶、0.2U/ml膽堿氧化酶、2U/ml辣根過氧化酶的反應緩沖液；10)在避光條件下于37℃孵育反應物1小時或更長時間；11)用熒光微板讀取器檢測熒光，其中激發(fā)波長為530-560nm，并在590nm處檢測發(fā)射光；12)對每一個值，通過減去非鞘磷脂酶對照的值來對背景熒光進行校正。 |
| 摘要 | 本發(fā)明披露了一種熒光分析方法及用于該方法的檢測試劑盒，該方法用于檢測需要此種檢測的患者糞便中的堿性鞘磷脂酶(SMase)，因為堿性SMase是重癥病理狀態(tài)，如結腸癌的標記物。 |
| 國際公布 | WO2003/056031 英 2003.7.10 |
