公開(公告)號(hào)
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CN1544629A
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公開(公告)日
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2004.11.10
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN200310108622.8
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申請(qǐng)日期
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2003.11.11
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專利名稱
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重組鵝白細(xì)胞介素-2蛋白的制備方法及其用途
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主分類號(hào)
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C12N15/26
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分類號(hào)
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C12N15/26;C12P21/00;C07K14/55;A61K39/39;A61P31/00;A61P31/12;A61P33/00
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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浙江大學(xué)
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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周繼勇;陳吉?jiǎng)?王金勇;騰巧泱;吳建祥
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地址
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310027浙江省杭州市西湖區(qū)浙大路38號(hào)
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頒證日
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國際申請(qǐng)
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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杭州求是專利事務(wù)所有限公司
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代理人
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張法高
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國省代碼
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浙江;33
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主權(quán)項(xiàng)
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一種重組鵝白細(xì)胞介素-2蛋白的制備方法,其特征在于它的步驟如下:1)自浙東白鵝單核淋巴細(xì)胞中克隆出鵝白細(xì)胞介素-2(gsIL-2)的DNA片段與含有PBAD啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體pBAD/HisB組建成表達(dá)載體pBAD/HisB/gsIL-2;或者上述gsIL-2DNA片段與含有PAUG1啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pMETαB組建成分泌型表達(dá)載體pMETαB/gsIL-2;或者上述gsIL-2DNA片段與含有PAUG1啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pMETB組建成胞內(nèi)型表達(dá)載體pMETB/gsIL-2;2)用RM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過發(fā)酵擴(kuò)增大腸桿菌工程菌LMG194;3)用BMDY作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,通過發(fā)酵擴(kuò)增酵母工程菌PMAD11和PMAD16,在表達(dá)不同時(shí)間加氮源、碳源等營養(yǎng)素;4)大腸桿菌LMG194和酵母菌PMAD16誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即為gsIL-2粗制品,PMAD11表達(dá)的gsIL-2主要分泌于培養(yǎng)基中,經(jīng)過離心取上清即為gsIL-2粗制品。用Ni-NTAArgarose蛋白純化系統(tǒng)可得到gsIL-2純品;5)粗制品或純品加入甘氨酸等穩(wěn)定劑和助溶劑后,無菌過濾、分裝和凍干后制成成品,保存于-20℃的冷藏環(huán)境中。
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摘要
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本發(fā)明公開了一種重組鵝白細(xì)胞介素-2(gsIL-2)蛋白的制備方法及其用途。RT-PCR擴(kuò)增的浙東白鵝白細(xì)胞介素-2的DNA片段與原核表達(dá)載體pBAD/HisB、真核表達(dá)載體pMETαB和pMETB構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pBAD/HisB/gsIL-2、pMETαB/gsIL-2和pMETA/gsIL-2,分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌LMG194、酵母菌PMAD11和PMAD16后誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)量分別占菌體總蛋白的9~10%、20~25%和10~12%。大腸桿菌和酵母菌PMAD16誘導(dǎo)后經(jīng)超聲波裂解、離心去沉淀即為gsIL-2蛋白粗制品,PMAD11表達(dá)的gsIL-2主要分泌于培養(yǎng)基中,離心取上清即為gsIL-2蛋白粗制品。用Ni-NTAArgarose蛋白純化系統(tǒng)可以較快的得到gsIL-2純品,粗制品或純品可以作為免疫佐劑和疾病治療藥物。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)制備的重組gsIL-2蛋白,具有工藝流程簡單,生產(chǎn)成本低,穩(wěn)定性好,生物學(xué)活性高等特點(diǎn)。
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國際公布
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