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含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法

公開(公告)號 CN1437957A  
公開(公告)日 2003.08.27  
申請(專利)號 CN03115855.2  
申請日期 2003.03.12  
專利名稱 含乳蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法  
主分類號 A61K35/64  
分類號 A61K35/64;C12N15/86;A23K1/16;A61P31/00  
分案原申請?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(專利權(quán))人 浙江大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計)人 汪以真;許梓榮;黃海青  
地址 310027浙江省杭州市西湖區(qū)玉古路20號  
頒證日  
國際申請  
進(jìn)入國家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 杭州求是專利事務(wù)所有限公司  
代理人 韓介梅  
國省代碼 浙江;33  
主權(quán)項 含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法,其特征是包括以下步驟:1)取泌乳1-21天母畜乳腺腺泡,液氮冷凍研磨成粉末,提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到LF-cDNA,根據(jù)乳鐵蛋白基因特征設(shè)計一對各帶一個酶切位點的引物,利用RT-PCR技術(shù)得到DNA,PCR產(chǎn)物割膠純化后,用引物中對應(yīng)的兩個內(nèi)切酶雙酶切,定向連接入以上兩個酶切過的pGEM-3Z載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1,藍(lán)白斑篩選陽性克隆,再接種3ml液體LB培養(yǎng)基,37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)至少8小時;2)將以上培養(yǎng)的TG-1抽提質(zhì)粒,對應(yīng)雙酶切,割膠回收目的片段,定向克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pVL1393,得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF,同時用Bsu36 I酶切野生型桿狀病毒DNA,在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑:pVL139315.0μl,野生型桿狀病毒DNA 1.0μL,滅菌水10.0μL,lipofectin 14.0μL輕輕混勻,常溫下放置15分鐘,在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基,用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次,最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基,15分鐘以后,用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑,分三處滴入細(xì)胞中,輕輕搖勻,然后用parafilm密封,27℃培養(yǎng)5天;3)待細(xì)胞貼壁后,吸去培養(yǎng)液,將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋,吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中,搖動使之均勻,27℃感染1小時后,移去接種液,在病毒接種時將3%低熔點瓊脂糖熔化,保溫在40℃水浴中,然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20%胎牛血清的2X TC-100快速混合均勻,將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上,等膠凝固后封口,逐日觀察病毒斑生長情況,當(dāng)病毒斑明顯后,在顯微鏡下挑取分隔良好的12個病毒斑,接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中,至細(xì)胞呈感染態(tài)時,收集病毒液,向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液,37℃溫育1小時后,選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選,重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF;4)將純化的重組病毒每頭約106pfu注射5齡起蠶,喂給新鮮桑葉,飼養(yǎng)五天后于冰上收集蠶血,加入0.1%苯基硫脲,10000rpm離心10分鐘,取上清,再注射5齡起蠶,106pfu/頭,喂給新鮮桑葉,飼養(yǎng)5天,待家蠶發(fā)病后,收集病蠶冷凍干燥,粉碎,即得含乳鐵蛋白的全蠶粉。  
摘要 本發(fā)明公開了含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法,它是以桿狀病毒為載體,用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的。應(yīng)用本發(fā)明方法生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉,產(chǎn)率高,在生產(chǎn)和使用過程中對人畜安全無毒,適宜大批量生產(chǎn)和使用。以此方法生產(chǎn)的含乳鐵蛋白全蠶粉因含有殺菌抗病毒的乳鐵蛋白,故作為飼料添加劑在補(bǔ)充飼料蛋白的同時可起到抗病防病的作用,而且動物不會產(chǎn)生抗藥性,可部分或全部替代飼料中的抗生素。  
國際公布  
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