| 公開(公告)號 | CN1437957A |
| 公開(公告)日 | 2003.08.27 |
| 申請(專利)號 | CN03115855.2 |
| 申請日期 | 2003.03.12 |
| 專利名稱 | 含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法 |
| 主分類號 | A61K35/64 |
| 分類號 | A61K35/64;C12N15/86;A23K1/16;A61P31/00 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 汪以真;許梓榮;黃海青 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)玉古路20號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 韓介梅 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項 | 含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，其特征是包括以下步驟：1)取泌乳1-21天母畜乳腺腺泡，液氮冷凍研磨成粉末，提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到LF-cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白基因特征設(shè)計一對各帶一個酶切位點的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，PCR產(chǎn)物割膠純化后，用引物中對應(yīng)的兩個內(nèi)切酶雙酶切，定向連接入以上兩個酶切過的pGEM-3Z載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG-1，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，再接種3ml液體LB培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)至少8小時；2)將以上培養(yǎng)的TG-1抽提質(zhì)粒，對應(yīng)雙酶切，割膠回收目的片段，定向克隆進(jìn)轉(zhuǎn)移載體pVL1393，得到重組轉(zhuǎn)移載體pVL1393-LF，同時用Bsu36 I酶切野生型桿狀病毒DNA，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑：pVL139315.0μl，野生型桿狀病毒DNA 1.0μL，滅菌水10.0μL，lipofectin 14.0μL輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用parafilm密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動使之均勻，27℃感染1小時后，移去接種液，在病毒接種時將3％低熔點瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清的2X TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μg X-gal的溶液，37℃溫育1小時后，選取白斑按上述步驟進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得重組病毒HyBacPAK-LF；4)將純化的重組病毒每頭約106pfu注射5齡起蠶，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)五天后于冰上收集蠶血，加入0.1％苯基硫脲，10000rpm離心10分鐘，取上清，再注射5齡起蠶，106pfu/頭，喂給新鮮桑葉，飼養(yǎng)5天，待家蠶發(fā)病后，收集病蠶冷凍干燥，粉碎，即得含乳鐵蛋白的全蠶粉。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了含乳鐵蛋白全蠶粉的生產(chǎn)方法，它是以桿狀病毒為載體，用家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉的。應(yīng)用本發(fā)明方法生產(chǎn)含乳鐵蛋白全蠶粉，產(chǎn)率高，在生產(chǎn)和使用過程中對人畜安全無毒，適宜大批量生產(chǎn)和使用。以此方法生產(chǎn)的含乳鐵蛋白全蠶粉因含有殺菌抗病毒的乳鐵蛋白，故作為飼料添加劑在補(bǔ)充飼料蛋白的同時可起到抗病防病的作用，而且動物不會產(chǎn)生抗藥性，可部分或全部替代飼料中的抗生素。 |
| 國際公布 |
