雛鴨
病毒性肝炎的診治技術(shù)
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鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)簡稱鴨肝炎,是主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、高度致死性的傳染病。1950年,Levine P P和Fabricant J在美國首先報(bào)道了Ⅰ型鴨病毒性肝炎的發(fā)生。1954年,Asplin報(bào)道鴨病毒性肝炎在英國暴發(fā)流行。隨后,加拿大、西德、意大利、印度、法國、匈牙利、日本等國均有報(bào)道。1963年首次報(bào)道在我國的上海地區(qū)某些鴨場也發(fā)生鴨病毒性肝炎DHV-Ⅰ型。而DHV-Ⅱ型和DHV-Ⅲ型病毒分別于1965年發(fā)現(xiàn)于英國諾福克和1969年發(fā)現(xiàn)于美國長島,DHV-Ⅱ型至今尚無其他國家的報(bào)道。 但近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道了DHV-Ⅰ型的變異情況,Barnhardt株是在美國一個(gè)農(nóng)場分離到的一個(gè)明顯的血清學(xué)變異株,與DHV-Ⅰ型在中和試驗(yàn)中呈部分交叉反應(yīng)。在福州地區(qū)發(fā)現(xiàn)不能被標(biāo)準(zhǔn)DHV-Ⅰ型疫苗保護(hù)的鴨肝炎。蘇敬良等從疑似鴨肝炎的病死鴨體內(nèi)分離到1株與Ⅰ型、Ⅲ型鴨肝炎病毒無血清學(xué)交叉免疫反應(yīng)的小RNA病毒,暫時(shí)將其病毒稱為新型鴨肝炎病毒。 在該病的診斷上,依據(jù)其發(fā)病日齡、臨床癥狀和病理變化可做出初步診斷，但確診和病毒定型必須依賴進(jìn)一步的病原學(xué)和血清學(xué)診斷。目前，應(yīng)用于DHV的血清學(xué)診斷主要有中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)和免疫熒光等,下面就近年來的診斷方法做簡要概述。 1 臨床診斷 該病主要發(fā)生于3周齡以下的雛鴨,潛伏期短,常突然發(fā)病,感染雛鴨首先表現(xiàn)為跟不上群,此后短時(shí)間內(nèi)就停止運(yùn)動(dòng),蹲伏并半閉眼。病鴨身體側(cè)臥、兩腿痙攣后踢,頭向后背,呈角弓反張樣。雛鴨在出現(xiàn)癥狀后1 h左右就發(fā)生死亡。 剖檢特征性病變主要在肝臟,常表現(xiàn)為肝臟腫大、質(zhì)脆,外觀淡紅、
土黃或斑駁狀,表面有彌漫性出血點(diǎn)或出血斑；膽囊腫脹呈長卵圓形充滿膽汁,膽汁常呈褐色或淡茶色；脾臟和腎臟也多有不同程度的腫脹,表面有出血點(diǎn)或呈斑駁狀；心肌常呈淡灰色,質(zhì)軟有淤血,似開水煮樣；此外,部分病例還可見喉、氣管、支氣管等有輕度卡他性炎癥及腦充血、出血等現(xiàn)象[5]。根據(jù)該病的發(fā)病情況、臨床癥狀和病理變化可作出初步診斷。 2 實(shí)驗(yàn)室診斷 2.1 病毒的分離和初步鑒定 病毒初代分離一般使用鴨胚,在鴨胚中連續(xù)傳幾代后,很容易在鴨胚中增殖,Levine和Fabricant（1950)首次用鴨胚分離DHV獲得成功。因目前國內(nèi)尚無SPF鴨場,而鴨胚中又往往含有DHV母源抗體,妨礙病毒增殖,故試驗(yàn)研究以及制作疫苗時(shí)接種和傳代常用SPF雞胚,病毒感染后主要表現(xiàn)為胚胎蜷縮,發(fā)育不良,全身
水腫,體表充血且頭頸、背部等常有散在的針尖大小的出血點(diǎn)。肝臟為土黃、灰綠或鮮紅色,腫大、質(zhì)脆,出血點(diǎn)明顯,邊緣壞死或在表面有灰綠色或黃白色壞死區(qū),呈花斑狀,此外,有的雞胚尿囊液和卵黃囊還常呈綠色。胚體變化有一定的診斷意義。 獲得高純度的病毒抗原可以對病毒進(jìn)行電鏡直接觀察,并開展免疫學(xué)監(jiān)測、診斷以及分子生物學(xué)研究。Taylor(1967)試圖以硫酸銨沉淀、超速離心方法對細(xì)胞增殖的DHV進(jìn)行純化,但未能最終達(dá)到目的。以后很多學(xué)者嘗試著先離心初提,然后經(jīng)氯仿抽提,PEG反透析濃縮蔗糖密度梯度離心等方法進(jìn)行提純,以得到較為純凈的病毒,也未能如愿。楊奎以抗DHV IgG偶聯(lián)活化的Sepharose4B制成親和層析柱,提純感染致死的雛鴨肝臟勻漿中的病毒,電鏡下背景干凈,雜蛋白少,病毒大小約為40 nm,但病毒的特性未進(jìn)一步驗(yàn)證。孫剛等在電鏡下可見到直徑為32 nm～49 nm的病毒粒子,顆粒結(jié)構(gòu)清晰,大小和結(jié)構(gòu)均符合Ⅰ型ＤＨＶ的特征。 DHV由于病毒顆粒較小,得到較為純化的病毒一直困擾著研究者,很多學(xué)者通過各種提純的方法進(jìn)行嘗試,但至今尚未見到一張確切的純化病毒的電鏡
照片。 2.2 中和試驗(yàn) 由于至今尚未明確DHV的基因序列,因此該病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠血清學(xué)中和試驗(yàn)加以診斷。Levine P R等（1950)首先將中和試驗(yàn)(Virus-neutralization test, VN)應(yīng)用于DHV診斷鑒定,以后逐漸為各國學(xué)者所引用。通常在雞胚上以固定血清-稀釋病毒法進(jìn)行,也有人在鴨胚、雛鴨或病毒適應(yīng)細(xì)胞中進(jìn)行試驗(yàn)。Hwang記述了一種準(zhǔn)確、可重復(fù)的Ⅰ型鴨肝炎病毒雞胚中和試驗(yàn)。Woolcock P R等[9]首先報(bào)道了用中和抗體進(jìn)行的空斑減少試驗(yàn),認(rèn)為要比雞胚中和試驗(yàn)敏感得多。Chalmers和Woolcock檢測了從16個(gè)非感染鴨收集的血清,其半數(shù)空斑減少滴度(VN)在1∶12到1∶250之間,平均1∶59。他們建議陰性對照血清的最大空斑減少滴度應(yīng)設(shè)為1∶250。Kaleta E F[10]用北京鴨腎細(xì)胞培養(yǎng)的DHV進(jìn)行了微量中和試驗(yàn),既快速又易于判定終點(diǎn)。陳琨等成功地在鴨胚單層肝細(xì)胞上進(jìn)行了DHV-Ⅰ型的微量血清中和試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DHV形成CPE的能力可以被特異性血清中和,可以用于病毒鑒定、疫病診斷和免疫檢測。 到目前為止,VN仍是診斷鴨病毒性肝炎的最可靠的方法,該方法被認(rèn)為是既特異又敏感,是公認(rèn)的方法。缺點(diǎn)為煩瑣、費(fèi)時(shí)，不能快速診斷,不適于基層應(yīng)用。 2.3 瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn) Murty等(1961)首次報(bào)道采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)診斷DHV。通過不同距離、不同濃度的抗原與高免血清沿瓊脂帶發(fā)生的瓊擴(kuò)反應(yīng),可用來檢測病毒抗原的滴度。許偉琦等試驗(yàn)表明在瓊脂中加入2%PEG能加快反映速度。張濟(jì)培等用瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測提純后的DHV,發(fā)現(xiàn)瓊脂凝膠配制的最佳方案是pH7.2,NaCl為80 g/L和瓊脂糖濃渡為10 g/L。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)雖然簡便易行,但準(zhǔn)確性存在欠缺,并且有干擾,因此存在著一定的局限性。 2.4 間接血凝試驗(yàn) 司興奎等報(bào)道在純化DHV獲得較為滿意結(jié)果的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步應(yīng)用純化抗原進(jìn)行間接血凝試驗(yàn)（IHA)。孫泉云等將初提DHV經(jīng)Sephadex G200柱層析純化后作為致敏抗原,
戊二醛法固定
綿羊紅細(xì)胞,BDB法致敏抗原紅血球建立了檢測DHV抗體的IHA方法。IHA試驗(yàn)敏感性高,所以致敏用抗原的純度要求高,而且必須保持良好的免疫活性。還有報(bào)道說21日齡前不易檢測到IHA抗體。所以對DHV早期診斷不適用。在敏感性和穩(wěn)定性方面有波動(dòng),限制了該方法的推廣應(yīng)用。 2.5 直接熒光抗體檢測 Maiborda(1972)報(bào)道了快速和準(zhǔn)確的診斷方法是接種雛鴨采用直接熒光抗體檢測（FA)。用FA確定了北京地區(qū)流行的DHV為I型。胡清海等用鴨胚細(xì)胞做成滴片進(jìn)行FA檢測DHV。劉建采用感染新型鴨肝炎強(qiáng)毒后死亡鴨的腎細(xì)胞做滴片進(jìn)行熒光染色,可檢測到病毒抗原存在,為臨床上快速診斷新型鴨病毒性肝炎提供了一種檢測方法。該方法準(zhǔn)確簡便,但對設(shè)備要求較高。 2.6 斑點(diǎn)免疫金滲濾法 張小飛等[18]用膠體金標(biāo)記提純后的
兔抗鴨肝炎病毒(DHV)IgG,建立了一種以微孔濾膜為固相載體,以紅色膠體金為標(biāo)記物的檢測DHV的斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA),并確定了最佳試驗(yàn)條件。該法既可定性,亦可定量,對純化DHV的最小檢測量為4.12 ng/點(diǎn),其敏感性為抗原斑點(diǎn)試驗(yàn)(AST)的2倍。DIGFA 法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。但其要求較高的抗原純度,這一點(diǎn)難以達(dá)到。 2.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行抗原、抗體的檢測,比較敏感、快速,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種疾病的診斷。 趙新柳等首次建立了間接ELISA法以檢測DHV抗體,結(jié)果表明，ELISA陽性檢出率為100%。陳溥言等[20]報(bào)道了DHV單克隆抗體的成功制備,并建立了檢測DHV的夾心ELISA方法,隨后范偉興等[21]用單克隆抗體建立了Dot-ELISA檢測方法。楊奎等用
辣根過氧化物酶標(biāo)記法成功地檢測了DHV抗體。該法與以polyomyl板或polystyrene為固相載體的ELISA法相比,抗原用量少,很適于DHV這類難以提純的病毒的抗體檢測。孫泉云等將單抗的高度特異性與ELISA的高度靈敏性結(jié)合起來,建立了用以檢測DHV抗體的單抗捕捉法ELISA方法,該法能有效區(qū)分陰、陽性血清,非特異性背景很小。同時(shí)對抗原的純度要求也很低,甚至是尿囊液也能克服非特異性反應(yīng)。楊萍萍等制備了DHV單克隆抗體,并用于檢測DHV。馬秀麗等[23]用辣根過氧化物酶標(biāo)記純化的Ⅰ型DHV單克隆抗體建立了檢測DHV的Dot-ELISA法。 很多學(xué)者建立了用以診斷DHV的ELISA方法,其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高,操作簡便,特異性強(qiáng)。但因病毒的純化和DHV陰性血清的制備等均存在一定難度,該方法在DVH的檢測診斷方面還未能得到廣泛的應(yīng)用。 2.8 其他血清學(xué)診斷方法 在DVH的診斷上除上述方法外,用來診斷鴨病毒性肝炎的方法還有被動(dòng)血凝試驗(yàn)，SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)，膠體金免疫電鏡技術(shù)，單克隆抗體-PAP法和核酸探針等方法,但因某些原因均還存在一定爭議,未能得到廣泛推廣和應(yīng)用。 3 小結(jié) 盡管多年來國內(nèi)外很多學(xué)者對DHV進(jìn)行了大量研究,但到目前為止,尚未能摸索出一種便捷的提純程序,因而至今尚未得到純化的病毒,這就使病毒的深入研究大受限制,對其分子生物學(xué)特性的研究也難以著手。因此,繼續(xù)進(jìn)行病毒提純方法的改進(jìn),將顯得尤為重要。 對于DHV診斷方法的研究,已經(jīng)取得了一定的成績,建立了許多基于血清學(xué)的診斷方法,基本能夠快速簡便地做出實(shí)驗(yàn)室診斷,但基層應(yīng)用存在一定的困難。也有很多學(xué)者建立了DHV的cDNA文庫,但還都有待于驗(yàn)證,并未見公開的DHV序列報(bào)道。因此,應(yīng)加緊其分子生物學(xué)研究,明確病毒的核苷酸序列，基因結(jié)構(gòu)，編碼蛋白質(zhì)的方式。用基因工程技術(shù)表達(dá)的重組抗原,或根據(jù)蛋白質(zhì)分子的某一抗原決定簇的
氨基酸序列。人工合成的多肽片斷抗原運(yùn)用到免疫學(xué)檢測方法中,或建立一種快速而準(zhǔn)確的分子生物學(xué)診斷方法,以解病毒是否存在著變異等難題。
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