豬瘟診斷及防治
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豬瘟俗稱"爛腸瘟"是一種具有高度傳染性疫病，是威脅養(yǎng)豬業(yè)是主要的一種傳染病，其特征是：急性，呈敗血性變化，實質(zhì)器官出血，壞死和梗死；慢性呈纖維素性
壞死性腸炎，后期常有副
傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)。 �。�1) 流行特點：本病在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和
野豬都易感，一年四季均可發(fā)生。病豬是主要傳染源，病豬排泄物和分泌物，病死豬和臟器及尸體、急宰病豬的血、肉、內(nèi)臟、廢水、廢料污染的飼料，飲水都可散播病毒，豬瘟的傳播主要通過接觸，經(jīng)消化道感染。此外，患病和弱毒株感染的母豬也可以經(jīng)胎盤垂直感染胎兒，產(chǎn)生弱仔豬、死胎、伊胎等�！ 。�2)潛伏期一般為5—7天，根據(jù)臨床癥狀可分為最急性、急性、慢性和溫和型四種類型。 A：最急性型：病豬常無明顯癥狀，突然死亡，一般出現(xiàn)在初發(fā)病地區(qū)和流行初期。 B：急性型：病豬精神差，
發(fā)熱，體溫在40—42℃之間，呈現(xiàn)稽留熱，喜臥、弓背、寒顫及行走搖晃。食欲減退或廢絕，喜歡飲水，有的發(fā)生
嘔吐。
結(jié)膜發(fā)炎，流膿性分泌物，將上下眼瞼粘住，不能張開，鼻流膿性鼻液。初期
便秘，干硬的糞球表面附有大量白色的腸粘液，后期
腹瀉，糞便惡臭，帶有粘液或血液，病豬的鼻端、耳后根、腹部及四肢內(nèi)側(cè)的皮膚及齒齦、唇內(nèi)、肛門等處粘膜出現(xiàn)針尖狀出血點，指壓不退色，腹股溝淋巴結(jié)腫大。公豬包皮發(fā)炎，陰鞘積尿，用手擠壓時有惡臭渾濁液體射出。小豬可出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)磨牙、后退、轉(zhuǎn)圈、強直、側(cè)臥及游泳狀，甚至
昏迷等�！ ：慢性型：多由急性型轉(zhuǎn)變而來，體溫時高時低，食欲不振，便秘與腹瀉交替出現(xiàn)，逐漸消瘦、貧血，衰弱，被毛粗亂，行走時兩后肢搖晃無力，行走不穩(wěn)。有些病豬的耳尖、尾端和四肢下部成藍紫色或壞死、脫落，病程可長達一個月以上，最后衰弱死亡，死亡率極高�！ ：溫和型：又稱非典型，主要發(fā)生較多的是斷奶后的仔豬及架子豬，表現(xiàn)癥狀輕微，不典型，病情緩和，病理變化不明顯，病程較長體溫稽留在40℃左右，皮膚無出血小點，但有淤血和壞死，食欲時好時壞，糞便時干時稀，病豬十分瘦弱，致死率較高，也有耐過的，但生長發(fā)育嚴重受阻�！ 。�3) 剖檢病變�！ 〖毙孕停喝砥つw、漿膜、粘膜和內(nèi)臟器官有不同程度的出血。全身淋巴結(jié)腫脹， 多汁、充血、出血、外表呈現(xiàn)紫黑色，切面如大
理石狀，腎臟色淡，皮質(zhì)有針尖至小米狀的出血點，脾臟有梗寒，以邊緣多見，呈色黑小紫塊，喉頭粘膜及扁
桃體出血。膀胱粘膜有散在的出血點。胃、腸粘膜呈卡他性炎癥。大腸的回
盲瓣處形成紐扣狀潰瘍。 慢性型：主要表現(xiàn)為壞死性腸炎，全身性出血變化不明顯，由于鈣磷代謝的擾亂， 斷奶病豬可見肋骨末端和軟骨組織變界處，因骨化障礙而形成的黃色骨化線�！ 。�4) 實驗室診斷：在口述診斷的基礎(chǔ)上，可用免疫熒光抗體檢查，酶標記組織抗 原定位法，免體交互免疫試驗，血清中和試驗，豬瘟單克隆抗體純化酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法之一進行確診�！ 。�5) 防治措施 預(yù)防：A、免疫接種。B、開展免疫監(jiān)測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗或正向間 接血凝試驗等方法開展免疫抗體監(jiān)測。C、及時淘汰隱性感染帶毒種豬。D、堅持自繁自養(yǎng)，全進全出的飼養(yǎng)管理制度。E、做好豬場、豬舍的隔離、衛(wèi)生、消毒和殺蟲工作，減少豬瘟病毒的侵入。 �。�6)疫情處理：A、立即報告，及時診斷。B、劃定疫點。C、封鎖疫點、疫區(qū)。D、處理病豬，做出無害化處理。E、緊急預(yù)防接種。疫區(qū)里的假定健康豬和受威脅地區(qū)的生豬即接種豬瘟免弱毒疫苗。F、消毒，認真消毒被污染的場地、圈舍、用具等，糞便堆積發(fā)酵、無害化處理豬瘟(hog cholera，HC或SWliqe fever， sF) 治療進展 在歐洲稱為古典豬瘟{classical swine fever．CSF)，是由豬瘟病毒(HCV或CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，豬是該病毒唯一的自然宿主。于1 833年首次發(fā)現(xiàn)于美國俄亥俄州，百余年來其流行遍及全球。國際獸疫局將其定為A類傳染病，我國《動物防疫法》將其列為一類傳染病．是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。中國豬瘟
兔化弱毒疫苗在防治豬瘟中曾起到?jīng)Q定性作用，但近幾年來出現(xiàn)免疫效果不理想．應(yīng)用組織培養(yǎng)弱毒苗也發(fā)生免疫失敗，究其原因比較多。由于豬瘟造成的經(jīng)濟損失巨大．歷來是各國研究的熱點�！ �1 csFV基因結(jié)構(gòu)與功能的研究 CSFV為有囊膜病毒，40--60 nm，單股正鏈RNA。CSFV基因組長約1 2 3 kb，僅含有一個大的開放性閱讀框架(ORF)．此ORF翻譯成含3898個
氨基酸殘基．分子量約438 kDa的多聚蛋白，并進一步在病毒和宿主細胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白．cSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼。ORF兩側(cè)是5’一端非翻譯區(qū)(5’-UTR)和3’一端非翻譯區(qū)(3’-UTR)．且5’一端無帽子結(jié)構(gòu)．3’一端無poly(A)尾巴。這一大前體蛋白以共翻譯和后翻譯的形式在細胞蛋白酶和病毒特異蛋白酶作用下．加工成結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒RNA上的編碼順序為Npro、c、Erns(E0)、E1、E2、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B。NS2-3可被加工成NS2、NS3(P80)，除c、E0、E1和E2為結(jié)構(gòu)蛋白外．其余均為非結(jié)構(gòu)蛋白�！ ∧壳耙呀�(jīng)定位的CSFV蛋白有5種，即 Npro、c、Erns(E0)、E1和E2．它們均由CSFV的 RNA-ORF5’一端所編碼。在結(jié)構(gòu)蛋白中，最具有免疫防制研究價值的是EO和E2�！ �1.1 c,是病毒的衣殼蛋白，也稱p14，由病毒ORF中的Setl 69～Al a267組成．是 CSFV核衣殼蛋白其N端由CSFV非結(jié)構(gòu)蛋白p23的水解作用產(chǎn)生，c端可能是由宿主細胞的信號肽酶作用所致。 1．2 gp44／48，是病毒的一種囊膜糖蛋白．也稱Erns．舊稱E0。有9個可能的糖基化位點，去糖基的蛋白骨架分子量約26KDa，由病毒ORF中Glu168-Ala494組成。在感染細胞中g(shù)p44／48在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)積累，并可存在于細胞膜表面或被分泌到胞外。在病毒粒子中g(shù)p44／48以97KDa的同源二聚體形式存在于囊膜表面。由于其分子內(nèi)缺乏疏水的膜錨定區(qū)，與病毒囊膜結(jié)合力弱．易從囊膜上游離下來。gp44／48可誘導產(chǎn)生豬瘟的中和抗體．免疫豬可誘導產(chǎn)生對致死量CSFV的保護性免疫。由于編碼 gp44／48的核酸序列在屬內(nèi)比編碼gp55的序列保守程度高，因此E rns可作為防治豬瘟的一種靶蛋白�！ rns具有RNase活性，作用于單鏈的 RNA．且對富含u的序列活性最高。4ng的 Ems在體外即可將CSFV基因組RNA完全降解。推測Ems沒有將其自身RNA降解掉的原因可能是由于空間上的隔離。在宿主細胞中，新合成的E rns在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)．而其基因組RNA則在胞漿中：在病毒粒子中，定位于囊膜的Ems與其基因組RNA間隔著衣殼蛋白．因此E rns是不會降解其自身RNA的。編碼Ems的基因是瘟病毒屬病毒所特有的．黃病毒科中其他病毒基因組內(nèi)無此基因．推測該基因是病毒與宿主細胞的RNase基因重組得到的�！ �1．3 gp33，是CSFV囊膜糖蛋白．也稱E1，去糖基的蛋白骨架分子量21．8KDa．由1 95個氨基酸殘基(ORF編碼的Leu495至GlY68。組成，內(nèi)有3個可能的糖基化位點。其蛋白骨架中有兩段疏水序列(Leu548～ Pro579～Gly689)。在多聚蛋白轉(zhuǎn)位過程中，前一段是E1向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔轉(zhuǎn)位的終止信號，后一段則充當E2轉(zhuǎn)位的信號肽，除此之外，這二段疏水區(qū)還充當E1的膜錨定位點。E1在病毒囊膜內(nèi)．不能誘導豬產(chǎn)生抗體。 1.4 gp55．為CSFV的另一囊膜糖蛋白，又稱為E2，是病毒主要的抗原蛋白，也是三個病毒糖蛋白中保守性最低．最易變異的分子。gp55常以100kDa的同源二聚體及與gp33形成75kDa的異源二聚體形式存在于病毒粒子及CSFV感染的細胞表面。在體外gp55可誘導產(chǎn)生病毒的中和抗體，體內(nèi)可誘導產(chǎn)生抗CSFV的攻擊的抗體。 Hulst用20μg昆曳細胞表達的E2雙相油包水乳劑免疫豬，能抵抗1 00LD50 CSFV Brescia毒株強毒的攻擊。gp55的蛋白骨架由370個氨基酸(ORF編碼的690-1060氨基酸殘基)組成．并以其c端的40個疏水氨基酸錨定在膜上。由于糖基化程度不同。E2的分子量可為51-58kDa。E2分子內(nèi)的1 5個Cys殘基在屬內(nèi)均保守，其中N端6個Cys殘基參與抗原結(jié)構(gòu)域的形成，c端9個Cys殘基則參與同源、異源二聚體的形成。 g p 5 5的抗原決定區(qū)在其N端部分(ORF編碼的第690-866氨基酸)，可分為2個獨立的抗原結(jié)構(gòu)單元，四個抗原結(jié)構(gòu)域A．B．C，D。其中結(jié)構(gòu)域A又可分為A．， A2，A3三個亞域。結(jié)構(gòu)域B．c屬于一個結(jié)構(gòu)單元．均為中和抗體的結(jié)合位點．由 ORF編碼的690～800氨基酸殘基參與構(gòu)成。Cys693與CYS7377形成的二硫鍵對結(jié)構(gòu)域 B、c的空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。另一個結(jié)構(gòu)單元含A．D抗原結(jié)構(gòu)域。A1、A2亞區(qū)定位于第795-851氨基酸殘基，在種內(nèi)保守A1是一個抗體的中和位點。亞區(qū)A3定位于766-813氨基酸殘基．而氨基酸殘基766-800則參與了結(jié)構(gòu)域D的構(gòu)成。cys792～ Cys856及Cys818～Cys828間的二硫鍵對這個結(jié)構(gòu)單元空問結(jié)構(gòu)的形成是必需的。連接這兩個結(jié)構(gòu)單元的是一段屬內(nèi)保守的疏水序列．推測這段序列參與了病毒侵入細胞過程中的膜融合過程。 1.5 Npro，也稱p23，CSFV的非結(jié)構(gòu)蛋白，是ORF編碼的多聚蛋白N端的第一個蛋白質(zhì)。Npro由168個氨基酸組成．具有蛋白質(zhì)水解酶活性，能以自催化的方式從正在翻譯的多聚蛋白上斷裂下來，成為成熟的病毒蛋白。序列比較發(fā)現(xiàn)，編碼p2 3的基因在瘟病毒屬中是較為保守的。它的斷裂位點在Cysl 68與其下游的病毒核衣殼p1 4 N端第一個氨基酸ser。間。Npro的 cys69和His130可能位于其酶活性中心．能水解斷裂Cys與Ala及Gly與Ser間的肽鍵，斷列位點位于活性His殘基下游38個氨基酸殘基處。Npro不參與CSFV的結(jié)構(gòu)及非結(jié)構(gòu)蛋白的加工過程．其蛋白酶活性在 c S F V增殖過程中的作用還不清楚。 Rumenapf等人使用定點突變技術(shù)對參與 Npro催化活性的氨基酸殘基進行測定．確定了其中的GIu22、His49和Cys69是保持Npro蛋白酶活性所必需的氨基酸殘基，而 His130并非必須�！ �2實驗窒診斷 目前豬瘟流行常常表現(xiàn)無規(guī)律的地區(qū)性散發(fā)．發(fā)病特征不典型，以發(fā)熱、精神沉郁、食欲減退、
咳嗽、共濟失調(diào)、結(jié)膜炎以及腹瀉、圍產(chǎn)期死亡、死胎、
流產(chǎn)。中等毒力及強毒感染有以上這些癥狀，并且在豬群中不分年齡快速傳播。結(jié)合這些臨床癥狀進行實驗室診斷是必要的。 2.1 病毒抗原的檢測豬瘟病毒抗原的快速檢測對于豬瘟的診斷具有特別重要的意義。目前快速、敏感的檢測方法是利用免疫組化技術(shù)檢測扁桃體組織。扁桃體中豬瘟病毒抗原可早在感染后2d檢測到．淋巴結(jié)、脾臟以及胰腺均可作為病毒早期檢測的組織樣品。Delas Mulas等及Narita等報道了一種檢測豬瘟病毒抗原的免疫組化方法．即利用針對E2糖蛋白的單克隆抗體檢測福爾馬林固定、石蠟包埋的組織樣品的免疫組化方法。該方法的優(yōu)點是能檢測長期保存的樣品，缺點是較費時．而且福爾馬林固定后的組織不能再進行病毒分離。利用鏈酶一生物素一過氧化物酶(ABc)的免疫組化方法也能用于豬瘟病毒組織切片上抗原的檢測。據(jù)報道流式細胞儀也可進行血樣中豬瘟病毒的檢測，但其敏感性較低。以豬瘟強毒感染仔豬，利用抗原捕獲ELISA方法檢測其病
毒血癥，結(jié)果表明該方法可用于豬群中
流行病學的調(diào)查。但其敏感性以及特異性均低于傳統(tǒng)的實驗室方法�！ �2.2 感染性病毒的檢測病毒分離是目前體外檢測感染性豬瘟病毒最特異的方法。已報道有幾種方法可以從組織、全血中分離病毒，白細胞是分離病毒的最佳樣品。然而一些研究人員發(fā)現(xiàn)，白細胞以及單核細胞在動物感染后較長時間才能感染病毒。因此，對于豬瘟的早期診斷．全血或血漿可能比白細胞更為敏感。最常用于豬瘟病毒分離的細胞為
豬腎細胞(PKl 5或SK6)或豬睪丸細胞(sT)。日本建立了一種豬腎由來的傳代細胞系(FS-L3)．FS-L3細胞在不感染病毒的情況下呈大園球狀．數(shù)倍至數(shù)十倍于普通細胞．但一旦感染了豬瘟病毒，F(xiàn)S-L3細胞的大園球狀即消失．這一特性已被用作豬瘟病毒的中和試驗等各種生物學特性的測定。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生細胞病變的毒株是因為它的遺傳基因發(fā)生了變化。從5’末端的第一個核苷酸到4764個核苷酸均已缺失．其中包括5’末端的非編碼區(qū)、自身蛋白分解酶、衣殼蛋白、糖蛋白(E0、 E1、E2)、非結(jié)構(gòu)蛋白NS-1、和NS-2的基因均已缺失�！ �2.3 豬瘟病毒基因組檢測 已報道利用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒RNA有數(shù)種程序。瘟病毒屬特異的引物多選自基因組的5’端保守區(qū)．其最突出的優(yōu)點是其產(chǎn)物能用來直接測序，直接進行病毒株的分型。一般來說套式RT-PCR方法是檢測豬瘟病毒更敏感的方法，但其缺點是比較費時．不適用于大量樣品的檢測。 McGoldrick等報道了一種檢測豬瘟病毒的單管熒光RT-PCR方法。此方法可檢測出仔
豬血樣中感染了中等毒力或高等毒力的豬瘟病毒，其敏感性高于病毒分離方法．并且簡化了試驗程序．減少了污染的風險．還可進行大量樣品的檢測�！ �2.4 抗體檢測最常用的檢測豬瘟病毒抗體的方法多以病毒中和試驗為基礎(chǔ)。目前已建立數(shù)個特異的檢測血清抗體的E LlSA方法．包括檢測針對粗蛋白、特異結(jié)構(gòu)蛋白如E2、E rns以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3抗體的方法。目前使用最廣泛的是CSFV E2 ELISA，其敏感性與VNT相比為90％～99％．特異性為99％。Leforban等建立了一種ELISA方法，能夠區(qū)分BVDV、BDV以及 CSFV抗體。這個方法對于BVDV／BDV高流行地區(qū)(如荷蘭)csF的檢測非常有意義。ELISA特異性與敏感性的提高是目前面臨的最大的挑戰(zhàn)�！ ‘斍埃i瘟仍是世界養(yǎng)豬業(yè)的一大威脅．1 997-1 999年期間在德國、荷蘭、西班牙和意大利等國都曾多次暴發(fā)了豬瘟，在我國CSFV的持續(xù)性感染和疫苗保護效力下降的現(xiàn)象也比較普遍，這不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，而且也給豬瘟防治政策的制定帶來了一定的困難。不過，相信隨著CSFV分子生物學和檢測方法研究的進一步深入，這些問題都會得到最終解決。
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