動脈粥樣硬化:第一節(jié)　載脂蛋白分離純化

一、分離脂蛋白

血漿是分離純化脂蛋白的首選標(biāo)本。從血漿（血清)中可分離得到CM、VLDL、LDL和HDL，再經(jīng)脫脂除去脂蛋白中的脂質(zhì)，剩下的部分為載脂蛋白的混合物。這一操作過程是獲得載脂蛋白的最佳方法。

二、脫脂

由于各種脂蛋白含脂的種類和質(zhì)量不同，脫脂劑組成略有差異。目前常用的幾種脫脂方法有如下幾種。

1．Warnick等法

將純化的脂蛋白慢慢加入到預(yù)冷（-20℃)的丙酮：無水乙醇（1：1，V/V)混合液中，脫脂液的量為樣品的20倍，不斷攪拌，然后在-20℃冰箱放置過夜，4℃離心沉淀，將沉淀重復(fù)脫脂一次，用氮?dú)獯蹈苫蛘婵崭稍铮�脫脂�?℃貯存待用。

2．Scanu等法

將脂蛋白加入到預(yù)冷的（-15℃)無水乙醇：無水乙醚（3：2)混合液中，不斷攪拌，以12h過夜，在-10℃或4℃離心（2000r/min)，去上清留沉淀，再重復(fù)脫脂一次。用N₂或真空干燥，0℃貯存待用。

三、載脂蛋白的分離純化法

（一)凝膠過濾法

凝膠過濾（gel filtration)技術(shù)是60年代興起的一種簡便有效的生物分離純化方法。當(dāng)混合溶液通過凝膠過濾層析柱時(shí)，因凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻于外部，在過濾的過程中，溶液中的物質(zhì)按不同分子量篩選分開，達(dá)到分離純化的目的。這一技術(shù)又稱為分子篩層析，或者稱為凝膠層析。

凝膠是不溶于水，在水中卻有較大膨脹度和較好的分子篩功能的一類化合物。目前主要有葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex)，天然瓊脂糖凝膠（商品名為Sapharose)、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio-Gel)，其后還發(fā)展了凝膠的各種衍生物，如羧甲基-交聯(lián)葡聚糖（CM-Sephadex)，二乙基氨乙基-交聯(lián)葡聚糖（DEAE- Sephadex)等種類。

由于凝膠過濾技術(shù)設(shè)備簡單、操作方便，重復(fù)性能好和樣品得率高等特點(diǎn)。廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)、核酸、多糖氨基酸、激素和抗生素等物質(zhì)的分離純化。凝膠層析在載脂蛋白的分離純化中，屬于使用最多的技術(shù)手段。

凝膠過濾裝置種類很多，其基本操作過程大同小異，操作步驟主要有：①凝膠種類的選擇，按被分離物的性質(zhì)及分子量大小而定；②凝膠柱的制備；③加樣與洗脫；④分部收集透析，濃縮。

載脂蛋白分離純化，多采用SephadexG-200層析分離。

1．ApoAⅠ、AⅡ的凝膠過濾分離純化法：①超速離心獲得HDL，以醇：醚（1：1)脫脂，-10℃脫脂6～8h，離心，棄上清留沉淀；②以6mol/L尿素Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH8.5)溶解沉淀；③加樣于SephadexG200凝膠柱。以6mol/L尿素Tris-HCl緩沖液(0.1mol/L,pH8.5)洗脫；④洗脫液經(jīng)紫外監(jiān)測儀（280nm)監(jiān)測后，由部分收集器按吸收峰分部收集；⑤對各組份進(jìn)行鑒定，收集需要的蛋白峰，透析，濃縮。

2．ApoE、CⅡ、CⅢ的凝膠過濾分離純化法：

ApoE、CⅡ、CⅢ均以VLDL為材料，與ApoAⅠ類同的方法進(jìn)行凝膠層析分離。

（二)親和層析法

親和層析是60年代末發(fā)展起來的一項(xiàng)分離純化技術(shù)，目前已得到廣泛的應(yīng)用。親和層析的原理與抗原對抗體、激素對受體和酶對底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理類同，每對反應(yīng)物之間都有一定的親和力。親和層析是把被識別的分子（底物、配體或抗原)以共價(jià)鍵結(jié)合到含有活化基團(tuán)的固相載體例如瓊脂糖珠上，然后使含有欲分離的大分子化合物的混合液從這個載體濾過，極大部分對配體沒有親和力的化合物，均順利通過載體而不滯留，欲分離的大分子能識別配體（有親和力)并與其結(jié)合，而滯留在層析柱上，等所有雜質(zhì)從層析柆上流走后即第一個層析峰出現(xiàn)后，改變洗脫條件，促使結(jié)合在配基上的大分子化合物解離下來并形成了第二個層析峰，原來混合液中欲分離的大分子化合物則以高度純化的形式在流出液中出現(xiàn)，得到需要分離純化的物質(zhì)。親和層析法幾乎適用任何可以純化的大分子化合物，如酶、抗體、抗原、激素、藥物、核酸、維生素結(jié)合蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、阻抑蛋白、載脂蛋白和其他調(diào)控成分等。

親和層析操作過程簡述如下。

1．載體的選擇

選擇親和層析所用的載體必須符合的條件有：①非特異性吸附要低；②有良好的流動特性；③在pH離子強(qiáng)度和變性劑濃度較大改變的情況下，化學(xué)和機(jī)械等理化性能穩(wěn)定；④具備大量能被活化的化學(xué)基因；⑤高度有效的多孔結(jié)構(gòu)。實(shí)際工作中，尤其是載脂蛋白的分離純化多用瓊脂糖珠（Sepharose 4B)作為載體選用。

2．配體（配基)的選擇

親和層析應(yīng)根據(jù)被分離純化的物質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)而選擇配本，一般考慮選擇的條件是；①與純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。作為載脂蛋白的純化常常選擇Apo的相應(yīng)抗體作為配體；②具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。

3．配體與載體的聯(lián)結(jié)

配體與載體共價(jià)聯(lián)結(jié)的方法包括：①載體功能基團(tuán)的活化；②配體與活化基團(tuán)的聯(lián)結(jié)。使二者進(jìn)行聯(lián)結(jié)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，使配體和載體均可耐受而不發(fā)生變性。

配體與載體的聯(lián)結(jié)方法有物理和化學(xué)的兩類。最常用的方法是化學(xué)法，化學(xué)法包括偶聯(lián)法和交聯(lián)法，又以交聯(lián)法常用，常用的化學(xué)試劑溴化氰（CNBr)環(huán)氧氯丙烷，雙環(huán)氧乙烯、丁二烯砜和亞氨二乙醇等，用其活化的載體與配體偶聯(lián)。或者使載體與配體螯合起來進(jìn)行聯(lián)結(jié)。

載脂蛋白純化的常用方法是溴化氰偶聯(lián)法，其操作過程包括：①活化，取一定的貯存載體Sepharose 4B用布氏漏斗抽干，加入等量的蒸餾水，并與等量的2mol/L的Na₂CO₃溶液（pH11～12)混勻。另取固體CNBr50～300mg/g貯存膠溶于二甲基甲酰胺溶液中，隨后迅速加到攪拌的Sepharose 4B懸浮液內(nèi)進(jìn)行活化，其pH始終保持11～12范圍。反應(yīng)過程中因?yàn)榉艧幔�故要用碎冰置于反�?yīng)杯周圍控制溫度在20℃左右，維持8～10min后再加碎冰，使其反應(yīng)物溫度制冷至4℃或更低的溫度。由于活化的Sepharose 4B破壞迅速，他的半壽期在4℃約為15min，故整個操作過程必須迅速進(jìn)行，以期盡快完成。將活化的Sepharose 4B反應(yīng)液迅速轉(zhuǎn)到布氏漏斗中，用10～20倍凝膠體積的預(yù)冷水及0.07mol/L溶液（pH8.3)洗滌。②偶聯(lián)，經(jīng)活化的洗滌過的載體與等體積的0.20～025mol/L碳酸鹽緩沖液(含0.5mol/l NaCl)混合，每ml約含配體如抗人ApoB₁₀₀-IgG100μg溶液（pH8～10)混合，緩慢攪拌2h（室溫)或4℃攪拌過夜，使載體與配體充分偶聯(lián)而形成固相載體。偶聯(lián)后在溶液中加入Tris-HCl溶液（pH8.0)，靜置2h，室溫下洗滌以除去過剩的配體（抗人ApoB₁₀₀-IgG)；③配體結(jié)合量的測定：配體結(jié)合量一般以每毫升或每克貯存膠偶聯(lián)配體的量表示，其數(shù)值可用作決定親和吸附劑實(shí)際用量的參數(shù)采用直接測定法或間接測定法測定結(jié)合量；④親和層析：將制備好的吸附劑CNBr-Sepharose-4B-配體（抗人ApoB₁₀₀-IgG)懸浮于平衡緩沖液中，然后加到裝有平衡緩沖液的垂直層析柱中，待形成層析床后，以緩沖液平衡層析柱，再將混合組份的樣品上柱，經(jīng)一定時(shí)間后，讓親和物與固相上的配體親和結(jié)合，爾后用一定鹽濃度的緩沖液洗去無親和力的無關(guān)組份。再洗脫結(jié)合的相親和物，因親和物與配體的結(jié)合雖然是非共價(jià)鍵結(jié)合。但比較牢固，一般緩沖液不能使其分開，此時(shí)必須在洗脫液中加入一定濃度的特殊化合物，一般采用破壞配體親和物結(jié)合鍵的化合物如用3mol/l NaCl或3mol/L的硫氰酸鹽或pH2～3的緩沖液可破壞抗原和抗體之間的結(jié)合，使抗原與固相抗體（或抗體與固相抗原)分離。若采用這一方法應(yīng)立即除去硫氰酸鹽或中和pH值等。

親和層析柱可反復(fù)使用，一次使用后，必須將結(jié)合于固相載體上的親和物全部洗脫干凈，一般采用上述相同的洗脫液進(jìn)行，再采用高濃度的中性鹽溶液如0.5mol/l NaCl充分洗脫非特異性吸附于配體上的雜質(zhì)，洗脫用緩沖液充分洗滌達(dá)到平衡后方可再度使用。在兩次間隔期，如果時(shí)間較長，可加入柳硫汞或疊氮，鈉等防腐劑以免細(xì)菌污染。

（三)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離純化法

電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的領(lǐng)域里。在載脂蛋白的分離純化中，電泳分離技術(shù)也是一種常被采用的方法。

因支持物的不同，電泳技術(shù)的種類有很多，本章著重介紹聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)有關(guān)的操作。

1．SDS-PAGE連續(xù)電泳洗脫分離純化法

利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，混合液中的各種蛋白按分子量大小依次停留在凝膠的不同位置。再經(jīng)染色脫色，即可見到多種蛋白區(qū)帶，這是作為鑒定的SDS-PAGE法。如果SDS-PAGE不停地進(jìn)行，含有多種蛋白混合液中的蛋白質(zhì)會按小分子到大分子的順序，使蛋白質(zhì)進(jìn)入陽極電極液中，若能設(shè)法分部收集從凝膠中電泳出來的各種蛋白質(zhì)即可達(dá)到分離純蛋白質(zhì)的目的。

BIO-RAD公司推出一種聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)或核酸的裝置，如圖17-1所示。該儀器利用連續(xù)洗脫電泳技術(shù)原理設(shè)計(jì)。電泳期間，蛋白質(zhì)或核酸在電場中，遷移到凝膠基質(zhì)，他們被分成環(huán)形的區(qū)帶，各個區(qū)帶依次遷移到凝膠底部，然后直接進(jìn)入洗脫室，洗脫室由聚乙烯材料組成，并貼有透析膜，下面再襯以支持網(wǎng)。在蠕動泵推動下，洗脫液呈輻射狀流入位于冷卻柱中心的洗脫管中，經(jīng)紫外監(jiān)測后流入分部收集器。按吸收峰收集相應(yīng)組份，即可得到被分離的蛋白質(zhì)。

圖17-1 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裝置

為了達(dá)到分離純化的目的，必須注意以下三方面的問題：

（1)凝膠孔徑的選擇：凝膠孔徑主要受總濃度T%（Arc+Bis)的影響，一般是T%越大，孔徑越小，其機(jī)械強(qiáng)度越強(qiáng)。當(dāng)T%固定時(shí)，Bis濃度在5%時(shí)，孔徑最小，高于或低于5%時(shí)，孔徑都相應(yīng)增大。最優(yōu)分離效果的凝膠孔徑必須保證其相對近移率（Rf)在0.55～0.6之間。

（2)凝膠長度的選擇：適當(dāng)?shù)哪�膠長度可以提高待分離蛋白質(zhì)的分離效果，過長易導(dǎo)致蛋白區(qū)帶擴(kuò)散，過短則達(dá)不到分離效果。最適凝膠長度主要考慮待分離蛋白質(zhì)與其相鄰近的蛋白質(zhì)分子量之間差異的大�。ā鱉W),△MW與凝膠長度呈反比關(guān)系。另外還應(yīng)考慮上樣量的多少，適當(dāng)減少上樣量可達(dá)到更好的分離效果。

（3)凝膠柱大小的選擇：選擇凝膠柱大小主要決定于制備上樣量的多少以及待分離蛋白質(zhì)與其鄰近蛋白△MW。Bio-RAD電泳儀有配套的28mm、3.6cm²和37mm的8.2cm²過濾柱。

（4)蛋白質(zhì)電泳的洗脫時(shí)間：主要維持Rf 0.55～0.60之間，凝膠柱越長，洗脫時(shí)間越長。也可以根據(jù)實(shí)際經(jīng)驗(yàn)選擇洗脫時(shí)間。

根據(jù)作用分離制備ApoAⅠ及堿性蛋白的經(jīng)驗(yàn)，上凝膠柱電泳前，應(yīng)將血清分別作適當(dāng)?shù)奶幚恚�如分離ApoAⅠ時(shí)，在血清采用肝素錳沉淀，留下含HDL的組份；分離堿性蛋白時(shí)，先用冷乙醇處理，留下含堿性m.payment-defi.com/Article/蛋白的組份。電泳分離純化前對血清作預(yù)處理，是分離成功的關(guān)鍵步驟。

2．聚丙烯酰胺凝膠（PAG)切割純化法

這一方法利用SDS-PAGE，使分離不同分子量的蛋白質(zhì)，依據(jù)待分離的特定蛋白質(zhì)的位置，進(jìn)行切割，再搗碎其凝膠，使蛋白質(zhì)析出，而達(dá)到分離純化的目的。筆者以此方法已分離純化了ApoBⅠ、ApoE等蛋白質(zhì)。方法簡便易行，缺點(diǎn)是回收率較低。

（四)等電聚焦分離法

等電聚焦（lsoelectro focusing ,IEF)又稱為等電點(diǎn)分離法，是利用一種含載體兩性電解質(zhì)（carrier ampholyte)的凝膠在電場中形成pH梯度，同時(shí)把具有兩性電解質(zhì)性質(zhì)的樣品（如蛋白質(zhì))聚集在他們的等電點(diǎn)相應(yīng)的pH區(qū)帶中，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。

等電聚焦，是1966年建立起來的一種高分辨率的蛋白質(zhì)分子或其他兩性分子的等電點(diǎn)的不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度載體中進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離分析或純化。

1．原理

等電聚焦技術(shù)必需的物質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在支持物（聚丙烯酰胺或瓊脂糖)中，必須要有一個穩(wěn)定的線性的pH梯度，形成這一線性pH梯度的物質(zhì)就是兩性載體。Rllbe早期發(fā)現(xiàn)谷胺酸、組氨酸和賴氨酸均能產(chǎn)生大約1pH的梯度，但pH范圍太窄，且緩沖能力不夠，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子本身也是兩性電解質(zhì)，在電泳時(shí)，他會影響梯度pH值，為此，要求形成pH梯度的物質(zhì)必須有足夠的緩沖能力來克服蛋白質(zhì)的影響。另外，還要求兩性載體電解質(zhì)必須有一個好的、均勻的導(dǎo)電性，使其整體系中保持電流暢通。1966年Vesterberg合成了一種兩性載體物質(zhì)，即由許多脂肪族的多羧基多氨基的異構(gòu)體和同系物組成的混合體，利用調(diào)節(jié)胺和酸的比例可得到含氨基與羧基不同比例的脂肪族多氨基多羧基。兩性電解質(zhì)的pI值將在大多數(shù)羧基的pK值和大多數(shù)氨基的pK值之間，多乙烯多胺鏈愈長，兩性電解質(zhì)的pI值也越連續(xù)，即可獲得平滑的pH梯度。如圖17-2所示。

圖17-2 平衡時(shí)載體兩性電解質(zhì)的濃度分布與pH梯度

兩性載體必須具備下述條件：

（1)較強(qiáng)的緩沖能力及可溶性：聚焦過程中，為了防止蛋白質(zhì)引起pH梯度的pH局部改變，保持pH梯度的穩(wěn)定，兩性載體必須具有較強(qiáng)的緩沖能力，特別是在被分離的蛋白等電點(diǎn)范圍的緩沖作用。

（2)具有好的均勻?qū)щ娦裕涸诘入娋劢怪�，對等電點(diǎn)處必須有足夠的電導(dǎo)，并要求各部位是均勻?qū)щ�，若局部電�?dǎo)過小，有可能產(chǎn)生極大的電壓降，局部發(fā)熱，不僅影響pH梯度，且易使蛋白質(zhì)產(chǎn)生熱變性作用，使凝膠燒壞。

（3)兩性載體本身紫外吸收值低：不與被分析的蛋白質(zhì)起化學(xué)反應(yīng)。

（4)無生物學(xué)效應(yīng)：該物質(zhì)對組織細(xì)胞及抗原的免疫性均無影響，也就是說若有少許兩性電解質(zhì)混入被分離的蛋白質(zhì)中，并不影響其任何生物學(xué)功能。

載體兩性電解質(zhì)，分子量在300～1000之間，其pK和pI值各不相同但相互接近，pH范圍在2.5～11之間，有pH范圍不同的各類載體兩性電解質(zhì)，瑞典LKB公司的商品名稱為“Ampholine”。

蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)分子，當(dāng)他在大于他的等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，就解離成帶負(fù)電的離子，在電場中就泳動到正極；當(dāng)他在小于他們的等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，他變解離成帶正電荷的離子，在電場中向負(fù)極泳動，這種泳動作用到達(dá)他的等電點(diǎn)的pH環(huán)境中，即他的凈電荷為零時(shí)才停止，此時(shí)帶電分子在電場作用下的遷移運(yùn)動與擴(kuò)散運(yùn)動達(dá)到平衡。如果在一個pH梯度的環(huán)境中進(jìn)行這種兩性電解質(zhì)（如蛋白質(zhì))的電泳，由于各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，就能把不同蛋白質(zhì)的分子按他們的等電點(diǎn)集中和分離在不同的區(qū)帶中。

圖17-3 蛋白質(zhì)的分離模式圖

箭頭代表移動向，箭頭長短代表移動速度，

右圖為平衡時(shí)蛋白質(zhì)的分離狀態(tài)。

現(xiàn)設(shè)有等電點(diǎn)不同的載體兩性電解質(zhì)a、b、c、d、e、f混合液，在電場中泳動，pI最低（即最酸的)的a（等電點(diǎn)為pI_a)集中在最接近陽極的部位，經(jīng)濃縮緩沖后，a處于等電狀態(tài)（a的實(shí)際電荷為零)，這部分pH與pI_a一致。僅高于a等電點(diǎn)的b（等電點(diǎn)為PI_b)同樣向正極電泳，但無法跨越a接近正極，與a比較，b帶正電荷，僅停留在a的負(fù)極端，這一部位的pH與pI_b一致。同理c停留在b的負(fù)極側(cè)……，f在最負(fù)極端。經(jīng)此電泳后，使這許多pI不同的載體兩性電解質(zhì)形成了從正極到負(fù)極分別為pI_a-pI_b-pI_c-pI_d- pI_e-pI_f的pH梯度。同時(shí)這些載體兩性電解質(zhì)具有足夠的緩沖能力，使被分離的電解質(zhì)不致于影響局部的pH值。又設(shè)有不同等電點(diǎn)的三種蛋白質(zhì)A、B、C，在兩種電極液分別為酸、堿的電場中泳動，A、B、C各自向自己等電點(diǎn)相同的pH部分移動。使電荷消失，停止移動，即A、B、C各自停留在與pI_A-pI_B-pI_C相同的pH部位，從而達(dá)到分離蛋白質(zhì)A、B、C的目的，如圖17-3所示。本方法裝置簡單，分辨力強(qiáng)，分離效果及重復(fù)性好，即可用于分離精制，也可作分析用，對標(biāo)本純度要求不嚴(yán)，但必須無鹽存在。

在等電聚焦中，分離僅僅決定于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，這是一個“穩(wěn)定”過程，一旦蛋白質(zhì)到達(dá)他的等電點(diǎn)位置，失去凈電荷，該蛋白質(zhì)就不能進(jìn)一步遷移停留在與某一蛋白pI相同的pH值位置。等電聚點(diǎn)的最大優(yōu)點(diǎn)是具有濃縮效應(yīng)（或稱為聚焦效應(yīng))，可以對抗擴(kuò)散，因此可以產(chǎn)生細(xì)窄穩(wěn)定的蛋白區(qū)帶。在這種電場中，蛋白質(zhì)即使會擴(kuò)散，由于是處于等電聚焦系統(tǒng)中，電極之間的pH梯度也是線性和連續(xù)的。如果蛋白帶向陰極擴(kuò)散，則將進(jìn)入高pH范圍而帶負(fù)電荷，陽極就將吸引他回去，直到他回到凈電荷是零的位置。如果他向陽極擴(kuò)散，則將帶正電，陰極將吸引他回到凈電荷是零的位置。因此蛋白質(zhì)只能在他的等電點(diǎn)位置被聚焦成一條窄而穩(wěn)定的區(qū)帶，如圖17-4所示。

圖17-4 IEF-PAGE圖（平板電泳)

等電點(diǎn)分離包括三個步驟：①載體兩性電解質(zhì)在電場中形成pH梯度；②兩性電解質(zhì)（如蛋白質(zhì))經(jīng)電泳分離停留在不同的pH區(qū)域；③被分離的兩性電解質(zhì)的鑒定和等電點(diǎn)（pI)的測定。

2．等電聚焦-聚丙烯酰胺圓盤電泳（IEF-PAGE)

（1)裝置與儀器：

電泳儀：與聚丙烯酰胺凝膠電泳相同。

凝膠用玻璃管：5×65mm或5×120mm，作為做管狀凝膠用，以下以管狀凝膠為例。

（2)試劑：

以上配方可制成最終濃度為7.5%凝膠，供分子量10萬以下的蛋白質(zhì)如ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅡ、CⅢ、E、H等分離純化或鑒定使用。分子量大于10萬的蛋白質(zhì)可用T=3.5%～5%、C=4%～5.5%的凝膠。

（3)操作：

制膠：取C液10ml，加雙蒸水10ml，混合（冷天減壓排氣)，充填到準(zhǔn)備好的玻璃管距離項(xiàng)端5～10mm高，靜置待凝。

加樣：將已聚合之凝膠管上層水除去，置于電泳槽內(nèi)（如圖17-5)，2mA/管預(yù)電泳30min，上槽接

極，下槽

極，使凝膠內(nèi)形成pH梯度，預(yù)電泳畢，取出凝膠管，傾去管內(nèi)H₃PO₄液并用水洗膠面，再按圖加樣、電泳。

圖17-5 IEF裝置與標(biāo)本溶液的裝置（園盤電泳)

電泳：電壓300～350V，2mA/管，3h，如發(fā)熱，可置5℃低溫環(huán)境進(jìn)行，也可在200V電泳4～5h。

（4)pH梯度測定：

按聚丙烯酰胺凝膠電泳法小心推出凝膠，浸入5%TCA（10m/gel)使分離層固定，每隔1～2h換液一次，共5次，以除去載體及固定蛋白質(zhì)，再按聚丙烯酰胺凝膠電泳法所述之染色，脫色。

在IEF電泳中，帶兩根不加標(biāo)本的凝膠管，電泳畢，將凝膠剝下，按5mm之間隔切斷（兩根并攏同時(shí)切)分別置于0.5～1.0ml雙蒸水中浸泡過夜（4℃)，分別測出pH值，作圖，即得pH梯度曲線。

同時(shí)電泳的加有樣品的染色凝膠分別測出色帶位置，從pH梯度曲線中求出該蛋白之pI。

3．等電聚焦-聚丙烯酰胺平板電泳（IEF-PAGE)

（1)儀器與試劑：

儀器 水平式電泳槽、電泳儀、有機(jī)玻璃框架、玻璃板、酸度計(jì)、光m.payment-defi.com/zhuyuan/密度計(jì)。

（2)試劑：

凝膠貯存液（Acr30g、Bis0.3g，加水到100ml。)、0.35%過硫酸銨、TEMED、20%載體兩性電解質(zhì)（pH4～10或pH4～7)、固定液（甲醇150ml、水350ml、磺基水楊酸17.25g、三氯醋酸57.5g)、染色液（考馬氏亮蘭R-250約0.115g溶于100ml脫色液)、脫色液（乙醇500ml、醋酸160ml、加水到2000ml)、1m H₃PO₄、1M NaOH。尿素、1%瓊脂糖液。

（3)操作：

制備聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦薄板

將10.0×7.6×0.2cm的有機(jī)玻璃框架置于相應(yīng)大的玻璃上，用滴管吸少量煮溶的瓊脂糖液，滴入有機(jī)玻璃框架與玻璃之間、待凝。防止漏水。

制膠：以測定ApoC的PAGE-IEF為例，將下述試劑放入50ml量筒內(nèi)。

加蒸餾水到20ml后，攪溶尿素，再加TEMED24μl，充分混勻后，迅速倒入裝置好的有機(jī)玻璃框架內(nèi)，再仔細(xì)蓋上一塊同樣大的玻璃，待凝。

預(yù)電泳：電泳槽的電極液分別為1M H₃PO₄（+)、1m NaOH（-)，四層濾紙搭橋，160V電壓下電泳40min。

加樣、電泳：以0.5×0.4cm大的小濾紙片間隔1.5cm距離插入凝膠內(nèi)，用微量注射器分別取待測樣品（蛋白質(zhì)混合液)30μl，慢慢地分別點(diǎn)加在各小濾紙片上，以160V電壓電泳約14h。

（4)pH梯度的測定：

電泳畢，取出凝膠板，沿正極到負(fù)極方向，平等切斷1cm寬的凝膠塊，按0.5cm長距離從正極到負(fù)極依次切下膠帶，并按順序分別裝入已編有號碼（1→14)的小橈壞杯內(nèi)，各加雙蒸餾水1ml，振蕩，靜置于冰箱過夜（或2h)，次日取出，平衡至室溫后，用pH計(jì)測定各膠片浸出液的pH值，以每片凝膠中心位置為原點(diǎn)，將各膠片中心位置對相應(yīng)浸出液pH值作圖，即得凝膠薄板上的pH梯度曲線。

準(zhǔn)確測量剩下的凝膠板從[

]→[

]的長度（染色前長度)，再浸入固定液固定1h，爾后將凝膠置于染色液染色3～5h，再用脫色液脫色至空白膠清晰為止，此凝膠可立即用光密度計(jì)掃描積分、定量，也可以干燥后保存。

測量染色后凝膠長度，求變形系數(shù)

變形系數(shù)=染色前膠長度/染色后膠長度

再量取凝膠正極端到染色區(qū)帶的距離，乘以變形系數(shù)，就等于染色區(qū)帶在染色前凝膠上相應(yīng)的位置。據(jù)此，可從pH梯度曲線上查出蛋白的等電點(diǎn)。pH梯度曲線如圖17-6所示。

例如：染色前膠長（從

到

極)為7.0cm

染色后膠長（從+到-極)為7.8cm

變形系數(shù)=7.0/7.8=0.9

凝膠上的染色區(qū)帶（蛋白質(zhì))到正極的距離為1.5cm

0.9×1.5=1.35

以1.35為橫軸的數(shù)字查pH梯度曲線相當(dāng)于pH4.8，此為該蛋白質(zhì)的電點(diǎn)，即pI=4.8。

圖17-6 IEF-PAGE的pH標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

4．載脂蛋白的純化

等電聚焦技術(shù)對蛋白質(zhì)的分辨率很高，若要用作純品制備，可采用IEF-PAGE平板電泳。電泳完畢，從凝膠塊正中或邊緣切一小條（約0.3cm寬)先染色，確認(rèn)待測純品的區(qū)帶位置，再將未染色的凝膠蛋白區(qū)帶切下?lián)v碎、浸泡，浸泡液中即可得到蛋白純品。用IEF純化蛋白質(zhì)，一定要在電泳之前先處理一次得到粗制品，再行電泳。該法成本較高，得率較低。