網(wǎng)站首頁(yè)
醫(yī)師
藥師
護(hù)士
衛(wèi)生資格
高級(jí)職稱
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會(huì)議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
中醫(yī)理論中醫(yī)臨床診治中醫(yī)藥術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)中國(guó)方劑數(shù)據(jù)庫(kù)中醫(yī)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)OCT說明書不良反應(yīng)中草藥圖譜藥物數(shù)據(jù)藥學(xué)下載
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 中醫(yī)理論 > 中醫(yī)書籍 > 正文:第三節(jié) 放射性同位素標(biāo)記核酸探針
    

實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié) 放射性同位素標(biāo)記核酸探針

最常用的同位素是α-32PdNTP,3HdNTP,及35SdNTP,多用缺品平移法、末端標(biāo)記法,隨機(jī)引物延伸法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。在以mRNA制備cDNA時(shí),同時(shí)摻入標(biāo)記的脫氧核苷酸,制出cD-NA標(biāo)記探針。一、缺口平移法在適當(dāng)?shù)臐舛鹊腄Nase I作用下在一雙鏈DNA上制造一些缺口,再利用大腸桿菌…

最常用的同位素是α-32PdNTP,3HdNTP,及35SdNTP,多用缺品平移法、末端標(biāo)記法,隨機(jī)引物延伸法和反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記法。在以mRNA制備cDNA時(shí),同時(shí)摻入標(biāo)記的脫氧核苷酸,制出cD-NA標(biāo)記探針。

一、缺口平移法

在適當(dāng)?shù)臐舛鹊腄Nase I作用下在一雙鏈DNA上制造一些缺口,再利用大腸桿菌DNA聚合酶I 的5’—3’外切酶活性依次切除缺口下游的核酸序列,同時(shí)將四種脫氧三磷酸核苷(其中一種用放射性標(biāo)記)利用該酶5’—3’聚合活性補(bǔ)人缺口,使缺口逐個(gè)平稱并在平移過程中形成標(biāo)記的新生核酸鏈。此法也適用于探針的非放射性標(biāo)記。如32P標(biāo)記DNA探針(缺口平移法):反應(yīng)體積為25μl,內(nèi)含0.3μgDNA片段,4μl 0.2μmol/L dNTP, 1.1×106Bq [α-32P]dATP,1μl2萬倍稀釋的DNA酶和2μl DNA聚合酶I,6μl緩沖液[為50mmol/l Tris·HCl(PH7.2)、10mmol/l MgSO4、1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)和50μg/ml BSA],反應(yīng)在14進(jìn)行3h。標(biāo)記DNA經(jīng)Sephadex (G-50)柱層析回收。

二、末端標(biāo)記法

在大腸桿菌T4噬菌體多聚核苷酸激酶(T4PNK)的催化下,將γ-32P-ATP上的磷酸連接到寡核苷酸的5’末端上。要求標(biāo)記的寡核苷酸5’端必須帶羥基。反應(yīng)式為:

此法適用于標(biāo)記合成的寡核苷酸探針。如將底物改為Bio –11 –dUTP,也可以在3’端標(biāo)記上一個(gè)生物素。

寡核苷酸35S的3’—末端標(biāo)記法:將m.payment-defi.com/pharm/下列液體依次加入Eppendorf管中。

寡核苷酸(1 pmol)1μl

10×Tailingbuffer 2μl

[α-35S]2μl

雙蒸餾水14μl

末端脫氧核苷酸酶1μl(10Unit)

混合后,置于37水浴中1.5h。取出反應(yīng)管放入冰水中5min。加入下列液體:

TRNA(25mg/ml)3μl

1×TE(pH8.0)180μl

酚100μl

CTAa100μl

充分混合2min。離心15000r/min 5min。將上清液(約200μl)移入新的Eppendorf 管中,然后加入下列液體:

4mol/L醋酸胺100μl

100%酒精800μl

混勻,置冰浴中,15min。再15000r/min離心10min,在管底可見一白色沉淀塊(含tRNA及寡核苷酸)。吸去管中液體,然后加入1000μl80%酒精,混合1~2min同上離心,吸除酒精(勿破壞沉淀塊),將管置于40℃溫箱中5min。加入適量的1×TE(pH8.0)及0.5mol/l DTT溶解沉淀。標(biāo)記探針的最終濃度是0.5ng/μl,DTT的最終濃度為20mmol/μl。取出1μl標(biāo)記探針測(cè)定比放射性,應(yīng)在1.0×10dpm/μg以上。保存在-80℃中1~2個(gè)月。再次使用時(shí)應(yīng)考慮到放射性同位素的衰減量。

三、應(yīng)用特異單引物法標(biāo)記DNA探針

應(yīng)用探針DNA上的一個(gè)片段作為DNA引物,以環(huán)化探針DNA的重組質(zhì)粒DNA為模板,在DNA聚合酶的作用下,通過變性,退火和延伸過程,使探針DNA得到標(biāo)記。反應(yīng)在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行,總體積為25μl,內(nèi)含50mmol/l Tris—HCl pH7.5, 10mmol/L MgCl2、BSa 5mmol/L、80ng引物DNA和0.1μg連接的DNA或0.1μg質(zhì)粒。反應(yīng)管在95℃變性5min,取出,稍離心,立即放入37℃C水浴保溫2min使DNA退火,加入1UE.coli DNA聚合酶I,在37℃進(jìn)行延伸反應(yīng)。對(duì)環(huán)化基因,延伸18min,對(duì)質(zhì)粒DNA延伸35min重復(fù)上述變性、退火和延伸過程1次。

四、雙引物法標(biāo)記DNA探針法

反應(yīng)在0.5ml管內(nèi)進(jìn)行,反應(yīng)體積為50μl,內(nèi)含50mmol/l Tris(pH7.5)、10mmol/l Mg-Cl2、10mmol/L β-巰基乙醇和500μg BSA/ml,引物片段1和2各90ng,模板DNA0.1μg,[α-32P]dCTp 1.5×106Bq,dATp 、dGTP和dTTP各200μmol/L。標(biāo)記反應(yīng)包括3個(gè)步驟:

(1)變性:反應(yīng)管在95℃水浴5min,然后離心;

(2)退火:37℃水浴2min;

(3)延伸:加入DNA聚合酶i 1u,37℃水浴18min。重復(fù)上述變性、退火、延伸過程1~2次,分別進(jìn)行其標(biāo)記率測(cè)定:取0.5μl反應(yīng)液分別點(diǎn)于兩張濾紙片上,烤干。一張經(jīng)0.6mol/L三氯醋酸(TCA)、0.3mol/l TCA依次洗滌,每次10min,然后再用無水乙醇,醇醚混合液和乙醚洗滌各5min。兩張濾紙分別放入閃爍瓶?jī)?nèi),測(cè)定cpm值,達(dá)到108cpm/μg DNA以上。

五、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)標(biāo)記高活性DNA探針

在0.5ml離心管內(nèi)進(jìn)行,反應(yīng)總體積為50μl,內(nèi)含模板DNA350ng,DNA引物各50pmol/L,dGTP、dCTP和dTTP各200μmol/L,[α-32P]dATp 1.1×106Bq,反應(yīng)緩沖液為67mmol/l m.payment-defi.com/sanji/Tris—HCl pH8.8含2.5mmol/l MgCl2、6.7mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/l β-巰基乙醇、170mg/l BSA、6.7μmol/l EDTA和40μl/ml二甲亞砜。將反應(yīng)管置于95℃水浴變性5min取出,加入Taq DNA聚合酶0.5~2u,在旋渦混合器上混勻簡(jiǎn)單離心一下,加入35μl石蠟油。放入65℃水浴2min,取出,立即進(jìn)入PCR循環(huán):91℃變性30s,51。C退火1min,68℃延伸2min。重復(fù)上述過程15次。最后將反應(yīng)管置65℃水浴5min。反應(yīng)完成,加入酵母tRNA10μg。分別測(cè)定參入和游離放射性計(jì)數(shù),參入率為97.4%。標(biāo)記DNA探針經(jīng)醋酸鈉酒精沉淀回收。將沉淀溶于10mmol/l Tris—HCl 、EDTA(pH8.0)100μl。用PCR方法標(biāo)記的DNA探針特異性高,敏感性好,可測(cè)出的最低靶DNA量為10fg,利用PCR還可以作DNA探針的非放射性標(biāo)記。

...
關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠(chéng)聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學(xué)論壇 - 醫(yī)學(xué)博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
醫(yī)學(xué)全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
皖I(lǐng)CP備06007007號(hào)
百度大聯(lián)盟認(rèn)證綠色會(huì)員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗(yàn)證