實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第二節(jié)　核酸(基因)探針目的核酸的制備技術(shù)

一、特異性目的核酸（或基因)的制備

核酸分子探針的制備首先需要獲得所要的特異性核酸或其片段�？捎靡韵路椒ㄖ苽�www.med126.com：

（1)直接分離基因核酸：即從基因組上直接用內(nèi)切酶切下所需基因。

（2)化學(xué)合成基因核酸：即以單核苷酸為原料，以固相磷酸三酯法合成某一結(jié)構(gòu)完全清楚，分子量較小的寡核苷核。

（3)酶促合成核酸：在真核細(xì)胞中獲得特異的結(jié)構(gòu)基因。常用方法是以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA，再以大腸桿菌DNA聚合酶I合成雙鏈的結(jié)構(gòu)基因。

（4)RNA探針。

二、目的核酸的擴(kuò)增

在獲得特異的目的基因后，可用以下方法大量擴(kuò)增制備：①用體外DNA重組技術(shù)與載體DNA相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中進(jìn)行無性繁殖。以氯化銫超速離心純化重組質(zhì)粒DNA，并以合適限制性內(nèi)切酶消化，經(jīng)凝膠電泳制備回收特異的目的核酸片段。②聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Poly－merase chain reaction, PCR)擴(kuò)增技術(shù)：利用這種先進(jìn)技術(shù)能簡便快速制備大量特異性目的核酸片段。PCR技術(shù)的基本原理是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特征，在體外用一對和欲擴(kuò)增DNA片段的兩側(cè)序列互補(bǔ)的引物誘發(fā)聚合反應(yīng)，即雙鏈DNA先高溫變性，然后在低溫下與引物退火，再在中等溫度進(jìn)行鏈延伸反應(yīng)。上述在三種不同溫度下的變性、退火和延伸為一個循環(huán)反應(yīng)，重復(fù)這種循環(huán)反應(yīng)可使DNA獲得指數(shù)性倍增，例如經(jīng)過35個循環(huán)反應(yīng)，DNA可擴(kuò)增1×10⁸倍以上。