實用免疫細胞與核酸:第一節(jié)　概述

1960年，美國學者Yalow 和Berson 創(chuàng)立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA)，并首先用于糖尿病人血漿中胰島素含量的測定。這是醫(yī)學和生物學領域中方法學的一項重大突破，開辟了醫(yī)學檢測史上的一個新紀元。它使得那些原先認為是無法測定的極微量而又具有重要生物學意義的物質得以精確定量，從而為進一步揭開生命奧秘打開了一條新的道路，使人們有可能在分子水平上重新認識某些生命現(xiàn)象的生化生理基礎。其后30年中，內分泌科學的飛速進展，充分證m.payment-defi.com/job/明了這一超威量分析技術的巨大推動力。1977年，這項技術的發(fā)明者榮獲諾貝爾生物醫(yī)學獎。隨后這一嶄新的技術迅速滲透到醫(yī)學科學的其它領域，如病毒學、藥理學、血液學、免疫學、法醫(yī)學、腫瘤學等，以及與醫(yī)學生物學相關的學科，如農業(yè)科學、生態(tài)學及環(huán)境科學等。放射免疫分析的物質，由激素擴大到幾乎一切生物活性物質。我們放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速發(fā)展與普及，對我國生物醫(yī)學的進展起著很大的促進作用。

一、放射免疫分析的優(yōu)缺點

（一)RIA的優(yōu)點

放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優(yōu)點。它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，因此能精確測定各種具有免疫活性的極微量的物質。

1．靈敏度高一般化學分析法的檢出極限為10^-3～10^-6g,而RIA通常為10^-9（毫微克，ng)、10^-12g（微微克,pg)，甚至10^-15g(毫微微克，fg)、10^-18g(微微微克，ag)。

2．特異性強由于抗原—抗體免疫反應專一性強，所被測物一定是相應的抗原。良好的特異性抗體，能識別化學結構上非常相似的物質，甚至能識別立體異構體。

3．應用范圍廣據不完全統(tǒng)計，目前至少已有300多種生物活性物質已建立了RIA。它幾乎能應用于所有激素的分析（包括多肽類和固醇類激素)，還能用于各種蛋白質、腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原以及一些小分子物質（如環(huán)型核苷酸等)和藥物（如地高辛、毛地黃甙等)的分析，應用范圍還在不斷擴展。近年來由于小分子半抗原制備抗體的技術有很大的發(fā)展，有人預測幾乎所有的生物活性物質，只要其含量不低于RIA的探測極限，都可建立適當的RIA法。

4．操作簡便RIA所需試劑品種不多，可制成配套試劑盒；加樣程序簡單一次能分析大量標本，標本用量也少；反應時間不長；測量和數據處理易于實現(xiàn)自動化；RIA屬體外分析技術，對患者無任何輻射危害。

（二)RIA的缺點

1．只能以免疫反應測得具有免疫活性的物質，對具有生物活性百失去免疫活性的物質是測不出的。因此RIA結果與生物測定結果可能不一致。

2．由于使用了生物試劑，其穩(wěn)定性受多種因素影響，需要有一整套質量控制措施來確保結果的可靠性。

3．靈敏度受方法本身工作原理的限制，對體內某些含量特別低的物質尚不能測定。

4．由于放射免疫分析是競爭性的反應，被測物和標準物都不能全部參與反應，測得的值是相對量而非絕對量。

5．存在放射線輻射和污染等問題。

盡管RIA存在以上缺點，但它畢竟是定量分析方法的先進技術。隨著科學技術的進步，放射免疫分析技術將會得到更加廣泛、更加深入的發(fā)展。

二、基本原理

放射免疫分析技術，是把放射性同位素測定與抗原、抗體間的免疫化學反應兩種方法巧妙地結合起來所形成的一種超威量物質的測定方法。

RIA的基本原理，是利用標記抗原（*Ag)和非標記抗原（Ag)對特異性抗體（Ab)發(fā)生競爭性結合。競爭結合反應可用下式表示：

在上述反應系統(tǒng)中，當只有*Ag和Ab時，只產生*Ag—Ab復合物，并保持可逆的動態(tài)平衡。如反應系統(tǒng)中同時加入Ag,因Ag 與*Ag 免疫活性完全相同，故與Ab具有www.med126.com相同的親合力。當*Ag為一定量、Ab為有限量、Ag 與* Ag 的量之和超過Ab上的有效結合位點時，*Ag –Ab復合物的生成量與Ag 的量之間呈一定的函數關系。即當Ag 量少時，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游離的*Ag 減少�？梢�*Ag –Ab復合物生成量是受Ag含量制約的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同濃度的標準物和一定量的*Ag及限量的Ab反應，采取一定方法將B與F分開，即可算出該標準物在各濃度下*Ag –Ab復合物的結合百分率（B/T)。

這一反應過程，可用以下簡圖（圖8-1)說明。圖中黑圈表示標記抗原，白圈表示非標記抗原，長條代表抗體，每個抗體有兩個結合位點，標記抗原與非標記抗原對抗體有同等的結合能力。

圖8-1 放射免疫分析原理示意圖

從圖中可見，當標記抗原與抗體量一定時，結合率（B/B+F)隨抗原量增加而降低。在實際工作中，以B/T的值為縱座標，標準物的濃度為橫座標，繪成曲線，即競爭性抑制曲線，或稱準確曲線。將未知濃度的樣品按同樣條件操作，所得結合率（%)與標準曲線相比，即可查出樣品中待測抗原的濃度。

放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知濃度的標準溶液，并各取一定體積；于其中加入一定量的標記抗原和特異性抗體；在一定條件下使之反應平衡后，采取適當方法將B與F分離；分別測量其放射性；繪制標準曲線（圖8-2)。對樣品中抗原的測定，則可在同樣條件下操作，在標準曲線上查得含量。

圖8-2 標準曲線

左：橫座標為等份刻度；　右：橫座標為對數刻度

由此可見，要成功地進行放射免疫分析，必須解決好以下3個關鍵性技術問題：

（1)標記抗原：要求其純度高、免疫化學活性好、比放射性強、用量適當。

（2)制備抗體：要求其特異性高、選用的稀釋度適當。

（3)分離B與F：理想的分離方法應當是分離完全、穩(wěn)定可靠、操作簡單、適用范圍廣。