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免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第四節(jié) 抗血清中抗體的純化

單價(jià)特異性是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。有時(shí)免疫原不純,含有微量的雜抗原(性質(zhì)相近的),制得的抗血清中出現(xiàn)2~3種雜抗體。即使用純抗原,例如用高度純化的IgG免疫動(dòng)物,出現(xiàn)的抗體總是有抗γ重鏈的抗體,也有抗κ輕鏈和抗λ輕鏈的抗體。還有一種情況,有些蛋白…

單價(jià)特異性是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。有時(shí)免疫原不純,含有微量的雜抗原(性質(zhì)相近的),制得的抗血清中出現(xiàn)2~3種雜抗體。即使用純抗原,例如用高度純化的IgG免疫動(dòng)物,出現(xiàn)的抗體總是有抗γ重鏈的抗體,也有抗κ輕鏈和抗λ輕鏈的抗體。還有一種情況,有些蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)處于一種結(jié)合狀態(tài),如甲胎蛋白常和白蛋白相結(jié)合,因此免疫得到的抗血清總是有抗白蛋白雜抗體存在。

一、除去雜抗體有兩種方法:

1.親和層析法將交叉雜抗原交聯(lián)到瓊脂糖珠4B上,如除去抗白蛋白抗體,則交聯(lián)上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清,裝柱后,將預(yù)吸收的抗體通過(guò)親和層析柱,雜抗體吸附在柱上,流出液則是單價(jià)特異性抗體。

2.吸附劑方法用不含特異性抗原的抗原液,即不含用于免疫動(dòng)物抗原的其他雜抗原液,如血清、組織液或已知的某種雜抗原,用雙功能試劑將其交聯(lián),做成固相吸附劑。如用不含甲胎蛋白的血清,稀釋1倍后,加入0.25%的戊二醛或丙酮醛,放冰箱一夜后,該血清成為膠凍狀,用力打碎(或用組織粉碎器),用緩沖液多次洗滌后,則成為顆粒狀的凝膠吸附劑。用這種吸附劑直接加到抗血清中(約1/10),抗原則與雜抗體結(jié)合,上清液則為無(wú)雜m.payment-defi.com/sanji/抗體的單價(jià)特異性抗體。有時(shí)因雜抗體太多,必須處理吸收兩次才能完全去除。吸附過(guò)的凝膠,用3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)洗滌,洗脫掉雜抗體,可再繼續(xù)使用。

有時(shí)雜抗原較少,其他蛋白也少,加入戊二醛后不形成膠凍狀,此時(shí)可加入無(wú)關(guān)蛋白進(jìn)行交聯(lián),如牛血清蛋白、血清、馬血清、卵白蛋白等。加入量以達(dá)到含總蛋白的2%~3%為宜。

二、特異性IgG抗體的制備

在標(biāo)記的免疫測(cè)定或其他技術(shù)中將特異性抗體純化出來(lái),是極為重要的。例如在ELISA,用于包被的抗體一定要用特異性IgG,才能得到良好的效果。這是因?yàn)槿逯杏写罅糠强贵w蛋白,如白蛋白、α1和α2球蛋白等,如不除去,會(huì)干擾包被。再如反相間接血凝,致敏紅細(xì)胞的抗體也需用特異性IgG的I(ab')2才能使實(shí)驗(yàn)滿(mǎn)意。特異性IgG和F(ab')2的制備方法有如下幾種。

(一)粗提法提取球蛋白

大多用硫酸銨鹽析法或硫酸鈉鹽析法。硫酸銨鹽析須經(jīng)過(guò)多次沉淀,第一次用40%飽和度,第二次用35%飽和度,第三次用33%飽和度,經(jīng)三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸鈉法更簡(jiǎn)便,用20%即可將γ球蛋白沉淀出來(lái)。經(jīng)鹽析后的γ球蛋白雖大多屬于IgG,但還有5%其他區(qū)帶蛋白,如γ區(qū)的雜蛋白。又因IgG組分中還含其他所謂正常的IgG,產(chǎn)生干擾。因此鹽析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的實(shí)驗(yàn),或者是抗體效價(jià)較高的抗血清。

(二)離子交換層析法提取IgG

常用的離子交換劑有DEAE纖維素或QAE纖維素,以QAE-Sephadex最為理想,DE22、32、52也可應(yīng)用。取QAE-SephadexA25或A50經(jīng)酸處理并在0.05mol/LpH7.5~8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡,將水分抽干,稱(chēng)濕重Ig加于10ml血清中,在室溫30min后,離心或過(guò)濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次,即獲得較純的IgG,甚至不含其他雜蛋白。用該技術(shù)純化IgG簡(jiǎn)便,不損壞抗體,既可小量提取,也可大量制備。

(三)親和層析法提取特異性IgG

將純化抗原或粗制抗原(如是單價(jià)特異性則對(duì)抗原要求不高)交聯(lián)Sepharose4B制成親和層析柱,將抗血清過(guò)柱后洗去未結(jié)合的雜蛋白,再用硫氰酸鉀洗脫,流出的是純的特異性IgG抗體。因硫氰酸鉀對(duì)抗體有破壞作用,應(yīng)及時(shí)透析除去。純化的IgG因含量低,失去保護(hù)作用,應(yīng)及時(shí)應(yīng)用或凍干保存,亦可20℃保存,但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保護(hù)作用。

(四)酶解法制備m.payment-defi.com/job/F(ab')2片段

胃蛋白酶對(duì)IgG的作用點(diǎn)是在連接兩重鏈的二硫鍵靠C端處(232氨基酸處),結(jié)果兩個(gè)Fab由二硫鍵連接,保留了抗體的結(jié)合點(diǎn)。與IgG相比,F(xiàn)(ab')2的特點(diǎn)是去掉了Fc段,這樣在細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)中免除了受體作用;同時(shí)也使IgG失去主要的抗原特性,不被抗IgG抗體結(jié)合;在反向間接血凝中,用F(ab')2致敏羊紅細(xì)胞比用IgG效果好。

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