實用免疫細胞與核酸:第五節(jié)　其它免疫電鏡技術

一、凝集素電鏡標記技術

凝集素的特性及標記原理詳見第五章　，近年來，凝集素電鏡標記技術應用日益廣泛，且獲得較為滿意的效果。凝集素電鏡標記技術方法較多，常用的有凝集素—酶（常用為HRP)、凝集素—生物素—酶電鏡標記技術�，F將凝集素—酶電鏡標記技術（包埋前染色)簡介如下（Sterit 和Kreatzberg,1987)。

（1)固定：常用為PLP或多聚甲醛—戊二醛固定液。如為取腦組織，可將已藻注動物在4^℃過夜，次日取腦組織置0.1mol/L磷酸或二甲胂酸鈉緩沖液（含7.5%蔗糖)中漂洗。

（2)振動切片機（Vibratome)切60μm的厚片。

（3)切片孵育在PBS（內含0.1mol/l CaCl_2、Mgcl₂和MnCl₂)10min（有作者主張此步可省略)。

（4)為增強細胞通透性，切片可孵育于含0.1%胰蛋白酶和0.1CaCl₂水溶液中，pH7.8,37^℃孵育30min。

（5)PBS洗3次，每次2min。

（6)凝集素—HRp 1：10 在PBS中（含0.1%Triton X--100)4℃過夜，最好不斷輕輕振蕩。

（7)PBS洗3次，每次2min。

（8)DAB-H₂O₂顯色。

（9)1%O_SO₄水溶液固定。

（10)系列酒精脫水，EPON包埋，切片。

（11)電鏡沿—鈾雙染觀察。

凝集素呈高電子密度常沉積在細胞膜上，易與電子染色相區(qū)別。

二、掃描免疫電鏡技術

掃描免疫電鏡技術可為研究細胞或組織表面的三維結構與抗原組成的關系提供可能性。

（一)標記物

應用于掃描電鏡的標記物應能在掃描電鏡可分辨的范圍內，并能對細胞或組織抗原有較好的定位能力。在選擇標記物時應根據研究目的而定，如標記細胞等由于體積較大，可用體積大的標記物；如鑒別陽性（標記細胞)與陰性（未標記細胞)，而要定位受體等則需選用較小的，易于辨認的標記物。

常用的標記物為顆粒性標記物。依其特性可分為：

1．蛋白類　如血藍蛋白、鐵蛋白等。

2．病原體類　如煙草花葉病毒、南方菜豆花葉病毒、噬菌體T₄、大腸桿菌f₂、噬菌體等。

3．金屬顆粒膠體金、免疫金銀標記技術和同位素放射性自顯影的銀顆粒等。其中以金屬類顆粒標記物應用最為廣泛。最常用的是膠體金，膠體金商品提供的直徑從3～150nm不等，掃描免疫電鏡常用的金顆粒直徑在30～60nm左右為宜。由于金本身系重金屬，有較強的發(fā)射2次電子的作用，故不需噴鍍金屬膜，這是膠體金應用于免疫掃描電鏡的標記優(yōu)于其它標記物之處。免疫金銀染色能加強細胞或組織表面金屬顆粒聚集的密度。金、銀粒在電鏡顯示為電子密度高，外形清晰的顆粒易于識別和定位。病原體標記物主要利用其特異殊的外形和結構以達到標記定位的目的，如噬菌體T₄形似星形的球拍，頭部大約100nm直徑，呈六角形星狀，尾長約100nm，由頸部與頭部相接；煙草花葉病毒為15×30nm的桿狀病毒，而南方菜豆花葉病毒是直徑25nm的園形顆粒，這些病原體的典型外形很易于辨認。鐵蛋白由于含有致密的鐵離子核心具有較高的電子密度，從而達到標記定位的目的。血蛋白是由海螺類軟體動物中提取的多分子聚合物，其外形為35×50nm的柱狀體，多應用于病毒研究，但也有利用血藍蛋白與過氧化物等的糖蛋白部份可與凝集素相結合的特性，進行細胞膜受體的定位。

（二)免疫標記方法

金屬類標記物的免疫標記法同切片免疫染色，即將標記物與抗體相結合，通過直接或間接法顯示抗原部位。膠體金可與蛋白A相結合后與IgG分子中的Fc 段相結合。哪與卵白素（a－vidin)相結合可與結合抗體的生物素（biotin)反應。免疫金銀染色法在膠體金標記后www.med126.com，再進行銀液顯影。病毒（包括噬菌體)標記物多采用不標記抗體法，即搭橋法。此法的原理是采用同種動物制備抗原的特異性抗體與標記物抗體（例如兔抗A抗原與兔抗HRP)。再用另一種動物制備第一種動物血清抗體的抗體（例如羊抗兔IgG抗體)。利用后者為橋，把抗原的特異性抗體與抗標記物抗體結合起來，后者再與標記物結合，以達到定位抗原的目的，其基本原理與PAP法類同。病原體免疫標記可不用標記物顯示，而利用其形態(tài)學特征定位或采用抗原抗體凝集法，其基本原理是利用病毒或病毒抗原的特異性抗體在與相應的抗原反應后，使后者之間發(fā)生交聯而凝集，經濃縮后用陰性染色法（負染)便可在電鏡下顯示定位部位。

（三)掃描免疫電鏡的具體操作步驟

1．標本處理

（1)細胞懸液：用10ml PBS 內含1mg/ml牛血清白蛋白（PBS—BSa )懸浮細胞，離心250g,5min×2。加入PBS—BSA 至10^5～10⁶細胞/ml，振搖成單細胞懸液。BSA能減低生物標本的非特異性吸附，但注意濃度應適宜，過高會減弱特異性反應。

（2)細胞附著于固體支持物：由于固定與免疫標記的孵育過程會引起細胞凝集，妨礙細胞表面的暴露，而且反復的離心與懸浮會導致細胞表面形態(tài)的改變。因此，通常將懸液中的細胞粘附于過濾膜或涂有帶正電荷聚合物的蓋玻片上，在粘附之前可依（1)法清洗標本，以除去細胞表面的附著物。固體支持物可用涂有多聚—L—賴氨酸薄膜的載片或直徑13nm、孔徑0.22或0.45μm的過濾膜，載片制備方法：多聚—L—賴氨酸（Sigma)100μg/ml重蒸溶解涂抹于載片上，4^℃30min后傾倒掉表面液體，令其自然干燥。注意載玻片事先需要清潔液浸泡，水漂洗過夜，然后浸泡于乙醇或丙醇中，用前取出自然干燥或用綢巾拭干。將細胞懸液（如細胞數少可事先離心，取沉淀細胞)，滴于濾膜或載片上，由于多聚賴氨酸的粘附性，在固定及免疫標記過程中細胞不至于脫落。但注意勿使細胞干燥。

（3)組織切片與固體組織：組織切片如為石蠟包埋應預先脫蠟，由二甲苯經梯度酒精至水。組織切片與固體組織（勿過大)均應以PBS—BSA沖洗，并保持濕潤避免干燥。

2．固定

（1)固定前用PBS—BSA沖洗5min×3。

（2)選擇加入適合的固定劑；可為4%多聚甲醛+0.1%～0.5%戊二醛在pH7.4的磷酸緩沖液中。室溫固定10～60min，或4^℃30～120min。

（3)PBS—BSA沖洗5min×3。

（4)除去殘留的自由醛基，選以下任一方法：

①0.5mg硼氫化鈉/1ml PBS 10min（新鮮配制)

②0.05～0.2mol/l 甘氨醊或賴氨酸—HCl/PBs 30～60min。

③0.1～0.5mol/L氯化鈉/PBs 30～60min。

④PBS—BSA沖洗5min×3。

3．免疫標記與透射免疫電鏡的原則及步驟基本相同。

免疫金銀染色法舉例（張留保等，1997)

（1)血細胞以PBS—BSA沖洗5min×3。

（2)2%多聚甲醛—戊二醛混合液固定，4^℃，1h

（3)PBS或TBS反復沖洗5min×3。

（4)膠體金免疫標記程序（略)

（5)暗室顯影液顯影

（6)掃描電鏡樣品制樣

（7)觀察

作者在血細胞膜外顯示了密集的金銀粒標記（特異性標記膜的谷胱甘肽過氧化物酶及激素肽)。

4．常規(guī)掃描電鏡標本處理

（1)PBS—BSA沖洗5min×3。

（2)后固定：2.5%戊二醛0.1mol/L磷酸緩沖液，時間視樣本大小而定，一般室溫30min左右。

（3)PBS—BSA洗5min×3。

（4)1%四氧化鋨后固定1～2h

（5)系列梯度乙醇或丙酮脫水

（6)臨界點干燥或冰凍干燥

（7)噴鍍碳與金

（8)掃描電鏡觀察

三、冷凍蝕刻免疫電鏡技術

冷凍蝕刻法（Freeze Ftching)，也稱冷凍復型法（Freeze Replica)或冷凍切斷（Freeze Fracture)，是研究生物膜結構的重要方法之一。其主要步驟首先是將樣品在液氮中冷凍，然后放到真空噴鍍儀中切斷，切斷后的切面上有細胞器，其間還有凍成洋的水分。再加熱使冰升華，將水份蒸發(fā)，把細胞器的膜結構暴露出來，這一步驟就稱為冷凍蝕刻。如不進行蝕刻就稱為冷凍切斷。向暴露的膜結構上噴鍍鉑—碳投影，再噴碳來加固。這樣就在切斷的樣品表面形成一層復型膜。在此復型膜上印下了細胞切面的立體結構。從真空中取出樣品，把復型膜下面的組織腐蝕掉，再把復型膜撈在銅網上，在透射電鏡下觀察復型膜。

關于生物膜的分子結構，目前被大家公認的并為冷凍復型電鏡觀察所證實的是流動鑲嵌型（圖7-1)，即脂質—球狀蛋白質鑲嵌模型。依照這上模型學說表明，生物膜是一種流動

圖7-1　生物膜分子的流動鑲嵌模型及冷凍斷裂面圖解

的、可塑的、鑲嵌蛋白質分子的脂質雙分子層的膜；脂質雙分子層中每一分子分別具有兩極，一端為親水極，朝向膜的內、外表面，而另一端的疏水極朝向膜的中線部位，兩排分子彼此相對，構成生物膜膜性結構的基礎。蛋白質分子彼此相對有嵌入性和表在性兩種，前者大約占蛋白質總量的3/4左右，外形近似球狀，鑲嵌在脂質分子層的不同深度內，而后者則大多附著于細胞膜的胞質面。在冷凍劈裂后，生物膜的水平斷面大多發(fā)生在單位膜的疏水極。因此，膜的親水部，分別命名為PS（與細胞質，核質或線粒體內基質相鄰的面)和ES（與細胞外間隙或細胞內間隙或細胞內間隙相鄰的面，如內質網腔、核質間隙、線粒體內、外膜之間的腔和其它各種泡的腔等)。膜的疏水部、亦即劈裂面分別叫做EF（面向細胞質、核質、或線粒體基質的面)和PF（向細胞外間隙或內間隙的面)。從70年代初期開始，冷凍蝕刻免疫電鏡技術已開始在應用，但由于免疫標記必須在冷凍蝕刻步驟以前進行，所以僅能標記細胞外表面（ES)。80年代開始建立了斷裂—標記細胞化學方法，將細胞膜劈開后，中央的兩側斷面（EF與PF)以及各種細胞器的膜的各個表面及細胞質與核質都能被標記，為此技術的廣泛應用創(chuàng)造了條件。應用此法還可對抗原與受體分子進行定量統計。

1．冷凍蝕刻表面標記免疫電鏡技術

（1)新鮮或固定的細胞進行直接法或間接法免疫標記。

（2)PBS（pH7.5)沖洗3min×2，加入1mmol/l MgCl₂蒸餾水洗洗3min×3，離心沉集細胞。

（3)將細胞團置于小紙板上，入液氮冷卻的Freon中，取出入冷凍蝕刻儀中進行斷裂操作，再于-100^℃蝕刻1min 。

（4)制做斷裂面復型。

（5)再次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗后進行觀察。

本法可顯示斷裂暴露的PF位于中央，周圍則是蝕刻后露出來的ES，標記物只出現在ES上。

2．斷裂—標記免疫電鏡技術

此法是先進行冷凍斷裂，再做免疫標記，從而可以對斷裂開的各種膜結構及胞漿斷面進行標記。

（1)臨界點干燥法

①固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4^℃1～2h，PBS沖洗3min×3。

如為細胞懸液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝膠化，將凝膠切成2mm左右的小塊，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷卻的Freon中冷卻。

②冷凍斷裂，將冰凍的凝膠小塊放在盛有液氮的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用預冷的解剖刀切割凝膠小塊進行冷凍斷裂。

③解凍，置碎塊于30%甘油—1%戊二醛磷酸緩沖液中解凍。

④置換甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS沖洗，3min×2。

⑤免疫標記。

⑥1%鋨酸，室溫固定30min。

⑦系列梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴鍍鉑—碳膜，次氯酸鈉清洗復型，蒸餾水洗，撈于有Formvar 膜銅網上透射電鏡觀察。

（2)超薄切片法

步驟：①至⑤同臨界點干燥法。

⑥1%鋨酸，室溫固定2h，系列酒精或丙酮脫水，常規(guī)電鏡包埋。

⑦切半薄片，光鏡定位合適的斷裂部位，再切超薄切片，鈾鉛染色，透射電鏡觀察。

斷裂標記法目前文獻報告應用較多的是植物凝集素—膠體金免疫標記技術，常用的如刀豆球蛋白（Con A)-- 膠體金免疫標記技術，如第六章　所述，Con A 能與細胞膜中的甘露糖結合，能標記內質網膜、核被膜以及細胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微結構水平的定位。

為保證實驗結果的準確性，每組實驗在免疫標記階段應設立對照組。對照組的設計同第一章　總論中的免疫對照染色。