葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質(zhì)。早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀。Jensen（1959)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了該抗原，并證明它是一www.med126.com種蛋白質(zhì)。為與A與糖相區(qū)別，Grov（1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA或蛋白A（Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起廣大免疫學者的興趣，并發(fā)展成為免疫學上一種極為有用的工具。
（1)SPA存在于大多數(shù)（90%)金黃色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血漿凝固酶陽性菌株，而不存在于陰性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在體內(nèi)研究中尚未發(fā)現(xiàn)SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關系。不同菌株間的SPA含量有明顯差異，以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和細胞壁的肽聚糖呈共價結合�？苟籽趸�青霉素突變株（Methicillin—resistant strain)能產(chǎn)生分泌性SPA，它較之細胞壁所含的SPA在免疫學性質(zhì)上相似，但易分離，損失少。
（2)SPA為蛋白質(zhì)成分，僅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而異，用脫氧核糖核酸酶消化細胞壁后超速離心或用加熱油提法，所測分子量為12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽中凝膠過濾，測出分子量為42000。SPA為多肽單鏈，內(nèi)含3個高度相似的Fc段結合區(qū)，每區(qū)由50個以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是賴氨酸，氨基末端結構尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等電點為pH5.1，其天然結構十分穩(wěn)定，在應用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級結構，如將此變性劑除去，則能自然矯正而恢復原有結構。
（3)SPA之所以引起免疫學家的重視，是因為它具有的免疫學特性。SPA具有和人與許多動物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結合的能力。SPA結合部位是Fc段而不是Fab段，這種結合不會影響抗體的活性。SPA具有的結合力是雙價的，每個SPA分子可以同時結合兩個IgG分子，也可一方面同IgG相結合，一方面與標記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結合。還有一個饒有興趣的事實是，和SPA結合后的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽等使之解離。SPA對IgG免疫球蛋白亞型的結合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG1、IgG2、和IgG4有結合力，唯獨不結合IgG3。只結合IgA2，而不結合IgA1。SPA和禽類血清IgG不結合。
（4)SPA具有多種生物學作用，如引起豚鼠解離體回腸和收縮，在吞噬反應中抑制IgG調(diào)理素吞噬和殺菌作用，SPA—Igg 復合物能固定人的補體和人、狗、豬的新鮮補體，對人類B細胞具有促有絲分裂因子的作用等。
自70年代開始，國外應用SPA建立了許多敏感、特異性強、快速和簡易的實驗方法，并在許多方面的應用中積累了實際應用的材料，現(xiàn)已廣泛應用到免疫學及其相關科學如細胞學、細菌學和病毒學等。其可能應用的范圍可歸納為以下四個方面：
1．應用于免疫球蛋白的制備和分析 SPA是一種比較理想的提純和分析免疫球蛋白的試劑。由于SPA與IgG及其某些亞型的Fc段有較強的結合力，可利用來提純、分析免疫球蛋白制劑，結合后的PSA—IgG可再用解離劑如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸鹽或6mol/L的鳥嘌呤鹽酸鹽使之解離，多用SPA—Sepharose 層析柱分離IgG或其亞型及斷片如Fc、Fab等。
2．應用于免疫細胞化學 由于SPA具有雙價結合力，在免疫細胞化學技術中可作為橋抗體或標記抗體。由于SPA能與多種動物的Im.payment-defi.comgG的Fc段結合，因此，作為第二抗體或標記抗體，SPA的最大優(yōu)點是不受種屬特異性的限制，故在目前各種免疫細胞化學技術中已得到廣泛的應用。除不受種屬限制這一特點外，SPA法還具有染色時間短、靈敏性高和背景染色淡等優(yōu)點。據(jù)報告用國產(chǎn)酶聯(lián)SPA代替酶標記抗體，應用間接染色，時間較PAP法省時一半。SPA分子量�。�13000～42000)，易于穿透組織，而免疫球蛋白酶標記抗體為200000，PAP復合物為430000，均較SPA分子量大。
3．應用于多種細菌、支原體和病毒等病原體的簡易快速診斷可應用SPA菌體作為載體，結合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集劑，用于某些細菌和病毒的定群和分型（詳見第二章 第三節(jié) )。
4．可作為一種研究免疫復合物、膜抗原、膜受體和膜Ig的固相吸附劑 Hallgsen用同位素標記SPA測定血IgG的凝集物，發(fā)現(xiàn)85%全身性紅斑狼瘡和42%類風濕病人血清中凝集物增高。SPA用于細胞膜抗原、表面IgG和Fc受體的研究最大特點是能研究活細菌。Ghetie（1976)用SPA致敏綿羊紅血球，與經(jīng)IgG處理的細胞形成玫瑰花環(huán)，來鑒定帶Fc受體的細胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花環(huán)形成，則可定量測定細胞表面的IgG。應用SPA與膠體金或鐵蛋白相結合，可在電鏡水平檢查抗原抗體反應的定位。特別是蛋白A—膠體金技術（Protein A—Gold technique, PGA技術)自Pomano和Romano（1977)首次報告用于標記細胞表面抗原、包括淋巴細胞、血小板、大鼠腎臟細胞及感染的病毒細胞獲得成功以后，已得到愈來愈廣泛的應用（詳見第七章 )，是一種較為理想的免疫電鏡技術。
SPA可為多種示蹤物如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等所標記，應用較廣的為酶標記SPA和金標記SPA技術，后者將在第七章 中敘述。標記SPA常用的酶為HRP�？蓱糜陂g接法。SPA在PAP法中可代替橋抗體。
1．SPA—HRP用于間接法的操作步驟
（1)切片經(jīng)脫蠟后用0.5%H2O2—純甲醇液處理5min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。
（2)用Tris鹽酸緩沖液（0.05mol/l pH7.6)洗2次，每次3min。
（3)以第一抗體血清覆蓋處理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
（4)用Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
（5)加SPA—HRP（1：100～1：400)處理30min。
（6)Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
（7)DAB—H2O2顯色。
（8)復染、脫水、透明、封固。反應物為棕色。
2．SPA用于PAP法的操作步驟
（1)切片脫蠟至水洗。
（2)80%甲醇（含0.6%H2O2)封閉內(nèi)源酶活性5min。
（3)10%卵白蛋白Tris緩沖液，20min。
（4)第一抗體作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
（5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩沖鹽液洗片5min。
（6)SPA（1μg/ml)5min。
（7)Tris-HCl鹽液洗5min。
（8)PAP復合物（無種屬限制)，5min。
（9)Tris-HCl鹽液洗切片5min。
（10)DAB（0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反應5min，然后水洗。
（11)復染：常用Mayer’s蘇木精液數(shù)秒至1min（視需要而定)，水洗。
（12)脫水、透明、封固、鏡檢。
3．SPA—HRP的制備 應用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。
（1)10mg 溶于新鮮配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氫鈉溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯無水乙醇溶液以封閉酶分子中的氨基，使不發(fā)生酶的自身聚合，室溫輕輕攪拌1h。
（2)加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批號的酶而定)的NaIO4，室溫攪拌30min。
（3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫輕攪1h。
（4)對1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩沖液充分透析（4℃，過夜)，換緩沖液3次。
（5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩沖液1ml，室溫輕攪2～3h。
（6)加5mg硼氫化鈉（NaBH4)終止氧化，置4℃冰箱3h或過夜。
（7)對PBS透析24h，4℃離心去沉淀，半飽和硫酸銨洗沉淀結合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
（8)對PBS充分透析，經(jīng)測定后分裝，貯于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
用過碘酸鈉法可以得到很高標記率的HRP-SPA標記物，而且保存了抗體的全部活性，敏感度高，穩(wěn)定性強，大大優(yōu)于戊二醛標記抗體法，國內(nèi)現(xiàn)在也有HRP-SPA的標記物供應，但要注意由于各家所用的SPA可能來源于不同菌株，在性質(zhì)上可能存在一些差異。
【注意事項】
①在使用二硝基氟苯后，會產(chǎn)生氟化氫，應充分透析除凈，否則抑制酶活性。
②標記時過碘酸濃度不宜過高，氧化時間不宜過長，否則會產(chǎn)生過度標記，即多個酶分子結合到一個蛋白A分子上。這些過度標記蛋白A的免疫反應性很差，容易產(chǎn)生非特異性染色。
③標記時加入酶與SPA的比例應適合，比值過大易產(chǎn)生過度標記，比值小則標記蛋白A產(chǎn)率低。
④過碘酸氧化結果能使酶具有多個醛基，從而能與多個蛋白分子的氨基相結合，成為一些大分子的聚合物。因此，有作者強調(diào)指出，對要求具有較強的細胞穿透力的免疫細胞化學實驗時應予以考慮是否適用。但國內(nèi)有實驗室應用上海生物制品所產(chǎn)生的應用過碘酸氧化法制備的HRP—SPA于免疫電鏡研究仍獲得了較為滿意的結果。
