很早以前，人們就注意到給動物飼以大量的雞蛋白，會引起明顯的“維生素H缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68000，屬于糖蛋白，當(dāng)時命名為卵白素（Avidin)，卵白素具有4個同維生素H（Riotin,又名生物素)親合力極高的結(jié)合點。給動物飼以大量雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量的維生素H結(jié)合所致。維生素H（以下統(tǒng)稱生物素)是一種小分子的維生素，分子量為244，系轉(zhuǎn)氨甲酰基化過程中的輔酶，它與卵白素之間有很強的親合力，較之抗體對抗原的親合力要高出100萬倍，能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。同時，生物素與卵白素都具有與其它示蹤物質(zhì)如熒光素、鐵蛋白和過氧化酶等相結(jié)合的能力。免疫細胞化學(xué)工作者利用上述特性，建立了卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)。由于維生素H習(xí)慣上稱為生物素，為便于理解，現(xiàn)在譯名上統(tǒng)稱卵白素為抗生物素或親合素。所以卵白素—生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素—生物素免疫染色法。
（1)基本原理：ABC法是Hsu 等于1www.med126.com981年在HRAB法和LAB法的基礎(chǔ)上改良的，其特點是利用抗生物素分別連接生物素標記的第二抗體和生物素標記的酶。與LAB法和BRAB法不同的是第一抗體不為標記物所標記，生物素標記的第二抗體與ABC復(fù)合物相連接。復(fù)合物是將過氧化酶結(jié)合在生物素上、再將生物素—過氧化酶連接物與過量的抗生物素蛋白反應(yīng)而制備的（圖6-1)，最后進行顯色反應(yīng)定位。
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圖6-1 ABC法
（2)操作步驟
①冰凍切片或石蠟切片均可。
②冰凍切片可用丙酮固定10min左右，0.01mol/l PBS (pH 7.2～7.6) 洗5min，更換3次。石蠟切片需經(jīng)脫蠟，系列酒精至水。
③第一抗體，室溫孵育15min。
④PBS洗5min，更換3次。
⑤加生物素標記的第二抗體（1：200左右)，孵育15min。
⑥PBS洗5min，更換3次。
⑦加ABC復(fù)合物室溫作用15min 。
⑧PBS洗5min，更換3次。
⑨用DAB—H2O2液（配法見附錄)顯色。
⑩復(fù)染。
⑾封片、觀察。
ABC復(fù)合物的配制：經(jīng)試驗，生物素與抗生物素之比為1：4時，能獲得最佳滿意效果。即抗生物素10μg/ml加2.5μg/ml生物素，應(yīng)用0.05mol/l Tris—HCl液，pH7.6，在應(yīng)用前30min配制。
（3)ABC法的評價及實驗注意事項
ABC法具有：①敏感性強：Hsu等應(yīng)用ABC法與PAP法相比發(fā)現(xiàn)敏感性較PAP法高20～40倍能顯示PAP法所不能顯示的抗原。這是因為生物素與抗生物素間有較強的結(jié)合力，一個抗生物素分子具有可與生物素結(jié)合的4個活性部位，其中一部分可與生物素標記的過氧化物酶相結(jié)合，另一部分可與生物素標記的免疫球蛋白結(jié)合。生物素通過氨基與抗體或過氧化物酶分子相結(jié)合，一個過氧化物酶或免疫球蛋白分子可以結(jié)合多個生物素分子，從而增加了免疫球蛋白或過氧化物酶結(jié)合抗生物素的能力。在ABC反應(yīng)中，抗生物素作為橋連接于生物素標記的酶和生物素標記的抗體之間，而生物素標記的過氧化物酶分子又可作為橋連接于抗生物素分子之間，于是形成了一個含有3個以上過氧化物酶分子（大于PAP復(fù)合物)的網(wǎng)格狀復(fù)合物，敏感性極大提高。②特異性強，背景染色淡：由于敏感性高，第一抗體和第二抗體都可被稀釋至盡可能的高度，減少了非特異性染色。③方法簡便，節(jié) 約時間：由于ABC法敏感，操作的抗原抗體反應(yīng)的時間可由PAP法所需的數(shù)天縮短為2h左右，各層抗體作用僅需15min。④國內(nèi)上海生物制品所等單位制備的生物素—抗生物素染色藥盒經(jīng)質(zhì)量鑒定符合標準，已提供國內(nèi)市場。⑤由于生物素與抗生物素具有和多種示蹤物結(jié)合的能力，可用于雙重或多重免疫染色。
實驗注意事項：
①內(nèi)源性生物素活性及其消除：生物素是一種輔酶，是在脫羧基酶、羧基轉(zhuǎn)換酶等催化的代謝環(huán)節(jié) 中所產(chǎn)生的羧基的中間載體，它存在于某些組織和細胞內(nèi)，在應(yīng)用ABC染色時會與抗生物素結(jié)合而產(chǎn)生非特異性染色。因此，對抗生物素結(jié)合性較高的組織如肝、腎、白細胞、脂肪組織和乳腺，在應(yīng)用ABC方法前應(yīng)預(yù)先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分別作用20min左右，以消除內(nèi)源性抗生物素結(jié)合活性，每次作用后用PBS洗5min，更換3次。Nar－itoku和Taylor（1982)報告神經(jīng)組織中的乳糖可與抗生物素結(jié)合產(chǎn)生假陽性反應(yīng)，以2—甲基-O-甘露糖預(yù)孵育切片可封閉神經(jīng)組織內(nèi)乳糖分子上的結(jié)合點，從而阻止與抗生物素蛋白的結(jié)合。必要時，也可用0.3%H2O2—100%甲醇孵育以消除內(nèi)源性過氧化 物酶活性。
②生物素制劑之間相互親合性差異大，因此在應(yīng)用ABC試劑時，應(yīng)注意廠家和批號，對購進試劑應(yīng)進行事先測試，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性。
③ABC試劑保存溫度以4℃為佳，據(jù)報告保存可達兩年之久，仍能獲得滿意效果，而在—20℃生物活性在短期內(nèi)即被破壞。
該技術(shù)方法是用生物素分別標記抗體和酶，然后以抗生物素為橋，把兩者連接起來（圖6-2)。
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圖6-2B RAB技術(shù)
檢查抗原時，先用生物素標記的抗體www.med126.com與細胞（或組織內(nèi))的抗原反應(yīng)，洗去未結(jié)合的抗體，加入抗生物素孵育后，洗去未結(jié)合的抗生物素，再加入已標記酶的生物素孵育，洗片，以細胞化學(xué)方法呈色反應(yīng)。
以生物素標記抗體作第一抗體，酶標記抗生物素作為第二抗體（圖6-3)。操作步驟如下：
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圖6-3 LAB技術(shù)
（1)切片在含有25～50μg/ml生物素標記抗體（PBS液稀釋)中孵育1h，室溫。
（2)PBS洗2次，每次5min。
（3)用20～50μg/ml過氧化物酶標記的抗生物素液孵育90min，水洗。
（4)酶呈色反應(yīng)。
BRAB法和LAB示是Guesdon及其同事們（1979)建立的，由于這二種方法都需以生物素標記第一抗體，應(yīng)用不如ABC法普遍。但用于免疫細胞中免疫球蛋白的顯示具有特異性。二者比較，LAB法手續(xù)較簡便，但靈敏度較低。
生物素—抗生物素染色法采用免疫細胞化學(xué)染色中各種常用固定劑（見附錄)，均可獲得較滿意的結(jié)果。但有實驗報告推薦“PLP”固定液（即過碘酸—賴氨酸—多聚甲醛固定液)，其配制法亦見附錄。PLP固定后，依次經(jīng)系列蔗糖磷酸緩沖液（10%，15%，20%各5min)，進行冰凍切片，貼于載片上，置室溫風(fēng)干30min或37℃3～4h或過夜。染色前用PBS濕潤水化切片，可獲得滿意染色效果。
