生物化學(xué)與分子生物學(xué):第三節(jié)　DNA的損傷與修復(fù)

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DNA存儲著生物體賴以生存和繁衍的遺傳信息，因此維護(hù)DNA分子的完整性對細(xì)胞至關(guān)重要。外界環(huán)境和生物體內(nèi)部的因素都經(jīng)常會導(dǎo)致DNA分子的損傷或改變，而且與RNA及蛋白質(zhì)可以在胞內(nèi)大量合成不同，一般在一個原核細(xì)胞中只有一份DNA，在真核二倍體細(xì)胞中相同的DNA也只有一對，如果DNA的損傷或遺傳信息的改變不能更正，對體細(xì)胞就可能影響其功能或生存，對生殖細(xì)胞則可能影響到后代。所以在進(jìn)化過程中生物細(xì)胞所獲得的修復(fù)DNA損傷的能力就顯得十分重要，也是生物能保持遺傳穩(wěn)定性之所在。在細(xì)胞中能進(jìn)行修復(fù)的生物大分子也就只有DNA，反映了DNA對生命的重要性。另一方面，在生物進(jìn)化中突變又是與遺傳相對立統(tǒng)一而普遍存在的現(xiàn)象，DNA分子的變化并不是全部都能被修復(fù)成原樣的，正因?yàn)槿绱松锊艜凶儺悺⒂羞M(jìn)化。

一、DNA的損傷

(一)DNA損傷的原因

1.DNA分子的自發(fā)性損傷

(1)DNA復(fù)制中的錯誤　以DNA為模板按堿基配對進(jìn)行DNA復(fù)制是一個嚴(yán)格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯誤的。堿基配對的錯誤頻率約為10－1－10－2，在DNA復(fù)制酶的作用下堿基錯誤配對頻率降到約10－5－10－6，復(fù)制過程中如有錯誤的核苷酸參入，DNA聚合酶還會暫停催化作用，以其3′－5′外切核酸酶的活性切除錯誤接上的核苷酸，然后再繼續(xù)正確的復(fù)制，這種校正作用廣泛存在于原核和真核的DNA聚合酶中，可以說是對DNA復(fù)制錯誤的修復(fù)形式，從而保證了復(fù)制的準(zhǔn)確性。但校正后的錯配率仍約在10－10左右，即每復(fù)制1010個核苷酸大概會有一個堿基的錯誤。

(2)DNA的自發(fā)性化學(xué)變化　生物體內(nèi)DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化，至少有以下類型：

a.堿基的異構(gòu)互變　DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化(例如烯醇式與酮式堿基間的互變)，這種變化就會使堿基配對間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥嘌呤等，如果這些配對發(fā)生在DNA復(fù)制時，就會造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯誤性損傷，如圖16－18所示。

圖16-18　腺嘌呤的稀有互變異體與胞嘧啶

(a)，或胸腺嘧啶的稀有互變異構(gòu)體與鳥嘌呤

(b)的氫鏈形成導(dǎo)致下一世代中G－C配對取代A－T配對

b.堿基的脫氨基作用　堿基的環(huán)外氨基有時會自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會變成尿嘧啶、腺嘌呤會變成次黃嘌呤(H)、鳥嘌呤會變成黃嘌呤(X)等，遇到復(fù)制時，U與A配對、H和X都與C配對就會導(dǎo)致子代DNA序列的錯誤變化。胞嘧啶自發(fā)脫氨基的頻率約為每個細(xì)胞每天190個。

c.脫嘌呤與脫嘧啶　自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來。一個哺乳類細(xì)胞在37℃條件下，20h內(nèi)DNA鏈上自發(fā)脫落的嘌呤約1000個、嘧啶約500個：估計(jì)一個長壽命不復(fù)制繁殖的哺乳類細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞)在整個生活期間自發(fā)脫嘌呤數(shù)約為108，約占細(xì)胞DNA中總嘌呤數(shù)的3%。

d.堿基修飾與鏈斷裂　細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O2、H2O2等會造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷，每個哺乳類細(xì)胞每天DNA單鏈斷裂發(fā)生的頻率約為5萬次。此外，體內(nèi)還可以發(fā)生DNA的甲基化，結(jié)構(gòu)的其他變化等，這些損傷的積累可能導(dǎo)致老化。

由此可見，如果細(xì)胞不具備高效率的修復(fù)系統(tǒng)，生物的突變率將大大提高。

2.物理因素引起的DNA損傷　射線引起的DNA損傷是最引人注意的。

圖16－19　胸腺嘧啶二聚體的形成

(1)紫外線引起的DNA損傷　DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應(yīng)開始的。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(～260nm)的紫外線照射時，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價鍵連成二聚體，相鄰的兩個T、或兩個C、或C與T間都可以環(huán)丁基環(huán)(cyclobutane ring)連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體，如圖16－19所示。

人皮膚因受紫外線照射而形成二聚體的頻率可達(dá)每小時5×104/細(xì)胞，但只局限在皮膚中，因?yàn)樽贤饩€不能穿透皮膚。但微生物受紫外線照射后，就會影響其生存。紫外線照射還能引起DNA鏈斷裂等損傷。

(2)電離輻射引起的DNA損傷　電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子(主要是水分子)吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化：

a.堿基變化　主要是由OH－自由基引起，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過氧化物的形成、堿基環(huán)的破壞和脫落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。

b.脫氧核糖變化　脫氧核糖上的每個碳原子和羥基上的氫都能與OH－反應(yīng)，導(dǎo)致脫氧核糖分解，最后會引起DNA鏈斷裂。

c.DNA鏈斷裂　這是電離輻射引起的嚴(yán)重?fù)p傷事件，斷鏈數(shù)隨照射劑量而增加。射線的直接和間接作用都可能使脫氧核糖破壞或磷酸二酯鍵斷開而致DNA鏈斷裂。DNA雙鏈中一條鏈斷裂稱單鏈斷裂(single strand broken)，DNA雙鏈在同一處或相近處斷裂稱為雙鏈斷裂(doublestrand broken)。雖然單鏈斷裂發(fā)生頻率為雙鏈斷裂的10-20倍，但還比較容易修復(fù)；對單倍體細(xì)胞來說(如細(xì)菌)一次雙鏈斷裂就是致死事件。

d.交聯(lián)　包括DNA鏈交聯(lián)和DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。同一條DNA鏈上或兩條DNA鏈上的堿基間可以共價鍵結(jié)合，DNA與蛋白質(zhì)之間也會以共價鍵相連，組蛋白、染色質(zhì)中的非組蛋白、調(diào)控蛋白、與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄有關(guān)的酶都會與DNA共價鍵連接。這些交聯(lián)是細(xì)胞受電離輻射后在顯微鏡下看到的染色體畸變的分子基礎(chǔ)，會影響細(xì)胞的功能和DNA復(fù)制。

3.化學(xué)因素引起的DNA損傷

化學(xué)因素對DNA損傷的認(rèn)識最早來自對化學(xué)武器殺傷力的研究，以后對癌癥化療、化學(xué)致癌作用的研究使人們更重視突變劑或致癌劑對DNA的作用。

(1)烷化劑對DNA的損傷　烷化劑是一類親電子的化合物，很容易與生物體中大分子的親核位點(diǎn)起反應(yīng)。烷化劑的作用可使DNA發(fā)生各種類型的損傷：

a.堿基烷基化。烷化劑很容易將烷基加到DNA鏈中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鳥嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻擊，烷基化的嘌呤堿基配對會發(fā)生變化，例如鳥嘌呤N7被烷化后就不再與胞嘧啶配對，而改與胸腺嘧啶配對，結(jié)果會使G－C轉(zhuǎn)變成A－T。

b.堿基脫落。烷化鳥嘌呤的糖苷鍵不穩(wěn)定，容易脫落形成DNA上無堿基的位點(diǎn)，復(fù)制時可以插入任何核苷酸，造成序列的改變。

c.斷鏈。DNA鏈的磷酸二酯鍵上的氧也容易被烷化，結(jié)果形成不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，易在糖與磷酸間發(fā)生水解，使DNA鏈斷裂。

d.交聯(lián)。烷化劑有兩類，一類是單功能基烷化劑，如甲基甲烷碘酸，只能使一個位點(diǎn)烷基化；另一類是以雙功能基烷化劑，化學(xué)武器如氮芥、硫芥等，一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等，某些致癌物如二乙基亞硝胺等均屬此類，其兩個功能基可同時使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間，以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。

圖16－20　氮芥引起DNA分子兩條鏈在鳥嘌呤上的交聯(lián)

(a)交聯(lián)附近的總圖；(b)交聯(lián)部分結(jié)構(gòu)圖

(2)堿基類似物、修飾劑對DNA的損傷　人工可以合成一些堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物，如5－溴尿嘧啶(5－BU)、5－氟尿嘧啶(5－FU)、2－氨基腺嘌呤(2－AP)等。由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基參入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成，例如5－BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時與A配對，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對，在DNA復(fù)制時導(dǎo)致A－T轉(zhuǎn)換為G－C。

還有一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)能專一修飾DNA鏈上的堿基或通過影響DNA復(fù)制而改變堿基序列，例如亞硝酸鹽能使C脫氨變成U，經(jīng)過復(fù)制就可使DNA上的G桟變成A桾對；羥胺能使T變成C，結(jié)果是A桾改成C桮對；黃曲霉素B也能專一攻擊DNA上的堿基導(dǎo)致序列的變化，這些都是誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)或致癌劑。

(二)DNA損傷的后果

上述損傷會最終導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)的變化，這種DNA分子水平上的突變(mutation)是整體遺傳突變的基礎(chǔ)。

歸納DNA損傷后分子最終的改變，有以下幾種類型：

1.點(diǎn)突變(point mutation)　指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤(A與G之間的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C與T之間的替代)稱為轉(zhuǎn)換(transition)；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換(transvertion)。

2.缺失(deletion)　指DNA鏈上一個或一段核苷酸的消失。

3.插入(insertion)　指一個或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(reading frame shift)，使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變(frameshift mutaion)。

4.倒位或轉(zhuǎn)位(transposition)　指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置、或從一處遷移到另一處。

5.雙鏈斷裂　已如前述，對單倍體細(xì)胞一個雙鏈斷裂就是致死性事件。

突變或誘變對生物可能產(chǎn)生4種后果：①致死性；②喪失某些功能；③改變基因型(genotype)而不改變表現(xiàn)型(phenotype)；④發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進(jìn)化。

二、DNA修復(fù)

DNA修復(fù)(DNA repairing)是細(xì)胞對DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來的功能；但有時并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這種DNA的損傷而能繼續(xù)生存。也許這未能完全修復(fù)而存留下來的損傷會在適合的條件下顯示出來(如細(xì)胞的癌變等)，但如果細(xì)胞不具備這修復(fù)功能，就無法對付經(jīng)常發(fā)生的DNA損傷事件，就不能生存。所以研究DNA修復(fù)也是探索生命的一個重要方面，而且與軍事醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等密切相關(guān)。對不同的DNA損傷，細(xì)胞可以有不同的修復(fù)反應(yīng)。

(一)回復(fù)修復(fù)

這是較簡單的修復(fù)方式，一般都能將DNA修復(fù)到原樣。

1.光修復(fù)　這是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。修復(fù)是由細(xì)菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特異性識別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶共價結(jié)合的二聚體，并與其結(jié)合，這步反應(yīng)不需要光；結(jié)合后如受300－600nm波長的光照射，則此酶就被激活，將二聚體分解為兩個正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。后來發(fā)現(xiàn)類似的修復(fù)酶廣泛存在于動植物中，人體細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)。

2.單鏈斷裂的重接　DNA單鏈斷裂是常見的損傷，其中一部分可僅由DNA連接酶(ligase)參與而完全修復(fù)。此酶在各類生物各種細(xì)胞中都普遍存在，修復(fù)反應(yīng)容易進(jìn)行。但雙鏈斷裂幾乎不能修復(fù)。

圖16－21　損傷DNA的切除修復(fù)

3.堿基的直接插入　DNA鏈上嘌呤的脫落造成無嘌呤位點(diǎn)，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)識別結(jié)合，在K＋存在的條件下，催化游離嘌呤或脫氧嘌呤核苷插入生成糖苷鍵，且催化插入的堿基有高度專一性、與另一條鏈上的堿基嚴(yán)格配對，使DNA完全恢復(fù)。

4.烷基的轉(zhuǎn)移　在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有一種O6甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶，能直接將甲基從DNA鏈鳥嘌呤O6位上的甲基移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基上而修復(fù)損傷的DNA。這個酶的修復(fù)能力并不很強(qiáng)，但在低劑量烷化劑作用下能誘導(dǎo)出此酶的修復(fù)活性。

(二)切除修復(fù)(excision repair)　是修復(fù)DNA損傷最為普遍的方式，對多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細(xì)胞中，也是人體細(xì)胞主要的DNA修復(fù)機(jī)制。修復(fù)過程需要多種酶的一系列作用，基本步驟如圖16?1所示，①首先由核酸酶識別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5′側(cè)切開磷酸二酯鍵。不同的DNA損傷需要不同的特www.med126.com殊核酸內(nèi)切酶來識別和切割。②由5′→3′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按5′→3′方向DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。④由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來的DNA斷鏈連接起來。這樣完成的修復(fù)能使DNA恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)。

圖16-22　DNA損傷后重組修復(fù)

(三)重組修復(fù)(recombinational repair)

上述的切除修復(fù)在切除損傷段落后是以原來正確的互補(bǔ)鏈為模板來合成新的段落而做到修復(fù)的。但在某些情況下沒有互補(bǔ)鏈可以直接利用，例如在DNA復(fù)制進(jìn)行時發(fā)生DNA損傷，此時DNA兩條鏈已經(jīng)分開，其修復(fù)可用圖16?2所示的DNA重組方式：①受損傷的DNA鏈復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。②另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口。③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)。

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)后合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個細(xì)胞是帶有損傷DNA的。

(四)SOS修復(fù)

“SOS”是國際上通用的緊急呼救信號。SOS修復(fù)是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，故又稱為錯誤傾向修復(fù)(errorprone repair)，使細(xì)胞有較高的突變率。

圖16－23　SOS修復(fù)

如圖16－23所示，當(dāng)DNA兩條鏈的損傷鄰近時，損傷不能被切除修復(fù)或重組修復(fù)，這時在核酸內(nèi)切酶、外切酶的作用下造成損傷處的DNA鏈空缺，再由損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的一整套的特殊DNA聚合酶桽OS修復(fù)酶類，催化空缺部位DNA的合成，這時補(bǔ)上去的核苷酸幾乎是隨機(jī)的，但仍然保持了DNA雙鏈的完整性，使細(xì)胞得以生存。但這種修復(fù)帶給細(xì)胞很高的突變率。

應(yīng)該說目前對真核細(xì)胞的DNA修復(fù)的反應(yīng)類型、參與修復(fù)的酶類和修復(fù)機(jī)制了解還不多，但DNA損傷修復(fù)與突變、壽命、衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)、某些毒物的作用都有密切的關(guān)系。人類遺傳性疾病已發(fā)現(xiàn)4000多種，其中不少與DNA修復(fù)缺陷有關(guān)，這些DNA修復(fù)缺陷的細(xì)胞表現(xiàn)出對輻射和致癌劑的敏感性增加。例如著色性干皮病(xerodermapigmentosum)就是第一個發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)缺陷性遺傳病，患者皮膚和眼睛對太陽光特別是紫外線十分敏感，身體暴光部位的皮膚干燥脫屑、色素沉著、容易發(fā)生潰瘍、皮膚癌發(fā)病率高，常伴有神經(jīng)系統(tǒng)障礙，智力低下等，病人的細(xì)胞對嘧啶二聚體和烷基化的清除能力降低。

小結(jié)

環(huán)境和生物體內(nèi)的因素都經(jīng)常會使DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。DNA的復(fù)制會發(fā)生堿基的配對錯誤；體內(nèi)DNA會有自發(fā)性結(jié)構(gòu)變化，包括DNA鏈上的堿基異構(gòu)互變、脫氨基、堿基修飾、DNA鏈上的堿基脫落等。外界射線的照射等物理因素，烷化劑、堿基類似物、修飾劑等化學(xué)因素都能損傷DNA的結(jié)構(gòu)，變化包括有相鄰嘧啶共價二聚體的形成、堿基、脫氧核糖和磷酸基團(tuán)的烷基化和其它修飾、堿基脫落、DNwww.med126.comA單鏈斷裂、雙鏈斷裂、DNA鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)、DNA與周圍的蛋白質(zhì)交連等。最后能導(dǎo)致DNA的點(diǎn)突變、DNA核苷酸的缺失、插入或轉(zhuǎn)位、DNA鏈的斷裂等，結(jié)果可能影響生物細(xì)胞的功能和遺傳特性，這些改變可能會導(dǎo)致細(xì)胞死亡、也有機(jī)會使細(xì)胞獲得新的功能或進(jìn)化，也可能細(xì)胞只有DNA結(jié)構(gòu)的遺傳性改變而沒有表型變化，視DNA結(jié)構(gòu)變化的部位、類型和范圍不同而異。

生物在進(jìn)化過程中獲得的DNA修復(fù)功能，對生物的生存和維持遺傳的穩(wěn)定性是至關(guān)重要的。對有些DNA的損傷，細(xì)胞能將其完全修復(fù)到原樣，如可將嘧啶二聚體切開、DNA單鏈斷裂可重新連接、堿基缺失可再配對插入、加成的烷基可以移除、一條鏈上的堿基或核苷酸的錯誤可以切除并依賴互補(bǔ)鏈作模板而復(fù)制重新修復(fù)等。對DNA較嚴(yán)重的損傷，細(xì)胞可采取重組修復(fù)、SOS修復(fù)等方式進(jìn)行反應(yīng)，以期提高細(xì)胞的存活率，但不能完全消除DNA的損傷，會帶給細(xì)胞較高的突變率。

DNA的損傷和修復(fù)與遺傳、突變、壽命、衰老、輻射效應(yīng)、腫瘤發(fā)生、某些毒劑的作用、以及某些遺傳性疾病等有密切的關(guān)系。目前對DNA損傷修復(fù)的認(rèn)識還不透徹。