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  生化筆記--沈同(適用第2版及第3版)第三章 蛋白質(zhì)           ★★★ 【字體:
生化筆記--沈同(適用第2版及第3版)第三章 蛋白質(zhì)
作者:未知 文章來(lái)源:醫(yī)學(xué)全在線 更新時(shí)間:2006-7-17

 

C端       N端。
掛接→去保護(hù)→中和→縮合→去保護(hù)→中和→縮合                 
第五節(jié) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)
二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈中有規(guī)則重復(fù)的構(gòu)象。
一、 肽鏈的構(gòu)象
多肽鏈的共價(jià)主鏈上所有的α--碳原子都參與形成單鍵,因此,從理論上講,一個(gè)多肽主鏈能有無(wú)限多種構(gòu)象。
但是,目前已知,一個(gè)蛋白質(zhì)的多肽鏈在生物體內(nèi)只有一種或很少幾種構(gòu)象,且相當(dāng)穩(wěn)定,這種構(gòu)象稱天然構(gòu)象,此時(shí)蛋白質(zhì)具有生物活性,這一事實(shí)說(shuō)明:天然蛋白質(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)。
1、 肽鏈的二面角
P143圖3-51、圖3-52

多肽主鏈上只有α碳原子連接的兩個(gè)鍵(Cα—N1和Cα-C2)是單鍵,能自由旋轉(zhuǎn)。
環(huán)繞Cα—N鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ
環(huán)繞Cα—C2鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱Ψ
多肽鏈的所有可能構(gòu)象都能用Φ和Ψ這兩個(gè)構(gòu)象角來(lái)描述,稱二面角。
當(dāng)Φ的旋轉(zhuǎn)鍵Cα-N1兩側(cè)的N1-C1和Cα-C2呈順式時(shí),規(guī)定Φ=0°。
當(dāng)Ψ的旋轉(zhuǎn)鍵Cα-C2兩側(cè)的Cα-N1和C2-N2呈順式時(shí),規(guī)定Ψ=0°。
從Cα向N1看,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)Cα-N1鍵形成的Φ角為正值,反之為負(fù)值。
從Cα向C2看,順時(shí)針旋轉(zhuǎn)Cα- C2鍵形成的Ψ角為正值,反之為負(fù)值。
2、 多肽鏈折疊的空間限制
Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在,因?yàn)閮蓚(gè)相鄰肽平面上的酰胺基H原子和羰基0原子的接觸距離比其范德華半經(jīng)之和小,空間位阻。www.med126.net
因此二面角(Φ、Ψ)所決定的構(gòu)象能否存在,主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無(wú)阻礙。
Cα上的R基的大小與帶電性影響Φ和Ψ

P144表3-12      蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離。

拉氏構(gòu)象圖:Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離,確定了哪些成對(duì)二面角(Φ、Ψ)所規(guī)定的兩個(gè)相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的,哪些是不允許的,并且以Φ為橫坐標(biāo),以Ψ為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)圖上標(biāo)出,該坐標(biāo)圖稱拉氏構(gòu)象圖。

P145  拉氏構(gòu)象圖(Gly除外)

⑴實(shí)線封閉區(qū)域
一般允許區(qū),非鍵合原子間的距離大于一般允許距離,此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的,且構(gòu)象穩(wěn)定。
⑵虛線封閉區(qū)域
是最大允許區(qū),非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間,立體化學(xué)允許,但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。
⑶虛線外區(qū)域
是不允許區(qū),該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象,都是不允許的,此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離,斥力大,構(gòu)象極不穩(wěn)定。
Gly的Φ、Ψ角允許范圍很大。
總之,由于原子基因之間不利的空間相互作用,肽鏈構(gòu)象的范圍是很有限的,對(duì)非Gly 氨基酸殘基一般允許區(qū)占全平面的7.7%,最大允許區(qū)占全平面20.3%。
二、 二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型
驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要?jiǎng)恿Γ?BR>(1)暴露在溶劑中的疏水基團(tuán)降低至最少程度。
(2)要保持處于伸展?fàn)顟B(tài)的多肽鏈和周圍水分子間形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)。
1、 α螺旋
(1)、 α螺旋及其特征
在α螺旋中,多肽主鏈按右手或左手方向盤繞,形成右手螺旋或左手螺旋,相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵,構(gòu)成螺旋的每個(gè)Cα都取相同的二面角Φ、Ψ。
典型的α螺旋有如下特征:
① 二面角:Φ= -57°, Ψ= - 48°,是一種右手螺旋
回憶 P143圖3-52

② 每圈螺旋:3.6個(gè)a.a殘基,  高度:0.54nm
③ 每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°,沿軸上升0.15nm
④ 氨基酸殘基側(cè)鏈向外
⑤ 相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈,氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。
⑥ 肽鍵上N-H氫與它后面(N端)第四個(gè)殘基上的C=0氧間形成氫鍵。
      圖
這種典型的α螺旋用3.613表示,3.6表示每圈螺旋包括3.6個(gè)殘基,13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個(gè)原子。

2.27螺旋(n=1)
310   螺旋(n=2,Φ= -49°, Ψ= - 26°)
613螺旋(n=3)
4.316螺旋(n=4)
封閉環(huán)原子數(shù)3n+4(n=1、2、.....)
         2.27     310      3.613      4.316
n=1     n=2     n=3      n=4
     α-螺旋   π-螺旋
(2)、 R側(cè)鏈對(duì)α—螺旋的影響
R側(cè)鏈的大小和帶電性決定了能否形成α—螺旋以及形成的α—螺旋的穩(wěn)定性。
① 多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸 殘基,(如Lys,或Asp,或Glu),則由于靜電排斥,不能形成鏈內(nèi)氫鍵,從而不能形成穩(wěn)定的α—螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。而當(dāng)這些殘基分散存在時(shí),不影響α—螺旋穩(wěn)定。
② Gly的Φ角和Ψ角可取較大范圍,在肽中連續(xù)存在時(shí),使形成α—螺旋所需的二面角的機(jī)率很小,不易形成α—螺旋。絲心蛋白含50%Gly,不形成α—螺旋。
③ R基大(如Ile)不易形成α—螺旋
④ Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤ R基較小,且不帶電荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α—螺旋。
(3)、 pH對(duì)α—螺旋的影響
多聚L-Glu和多聚L-Lys

P149  圖3-57

(4)、 右手α-螺旋與左手α-螺旋
        圖  P148
右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。
蛋白質(zhì)中的α—螺旋幾乎都是右手,但在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α—螺旋,由Asp-Asn-Gly-Gly(226-229)組成(φ+64°、Ψ+42°)。
(5)、 α-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性
由于α-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對(duì)稱的分子結(jié)構(gòu),因而具有旋光性,原因:(1)α碳原子的不對(duì)稱性,(2) 構(gòu)象本身的不對(duì)稱性。
天然α—螺旋能引起偏振光右旋,利用α—螺旋的旋光性,可測(cè)定蛋白質(zhì)或多肽中α—螺旋的相對(duì)含量,也可用于研究影響α—螺旋與無(wú)規(guī)卷曲這兩種構(gòu)象之間互變的因素。
α-螺旋的比旋不等于構(gòu)成其本身的氨基酸比旋的加和,而無(wú)規(guī)卷曲的肽鏈比旋則等于所有氨基酸比旋的加和。
(6)、 α-螺旋(包括其它二級(jí)結(jié)構(gòu))形成中的協(xié)同性
一旦形成一圈α-螺旋后,隨后逐個(gè)殘基的加入就會(huì)變的更加容易而迅速

2、 β-折疊
P149  圖3—58    P150  圖3—59

兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈(或同一肽鏈的不同肽段)側(cè)向聚集在一起,相鄰肽鏈主鏈上的NH和C=0之間形成氫鏈,這樣的多肽構(gòu)象就是β-折疊片。β-折疊中所有的肽鏈都參于鏈間氫鍵的形成,氫鍵與肽鏈的長(zhǎng)軸接近垂直。多肽主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象,側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。
平行式:所有參與β-折疊的肽鏈的N端在同一方向。
反平行式:肽鏈的極性一順一倒,N端間隔相同
平行式:φ=-119°    Ψ=+113°
反平行式:φ=-139°    Ψ=+135°
從能量上看,反平β-折疊比平行的更穩(wěn)定,前者的氫鍵NH---O幾乎在一條直線上,此時(shí)氫鍵最強(qiáng)。
在纖維狀蛋白質(zhì)中β-折疊主要是反平行式,而在球狀蛋白質(zhì)中反平行和平行兩種方式都存在。
在纖維狀蛋白質(zhì)的β-折疊中,氫鍵主要是在肽鏈之間形式,而在球狀蛋白質(zhì)中,β-折疊既可在不同肽鏈間形成,也可在同一肽鏈的不同部分間形成。
3、 β-轉(zhuǎn)角(β-turn)
β-轉(zhuǎn)角也稱β-回折(reverse turn)、β-彎曲(β-bend)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hair-pin structure)
β-轉(zhuǎn)角是球狀蛋白質(zhì)分子中出現(xiàn)的180°回折,有人稱之為發(fā)夾結(jié)構(gòu),由第一個(gè)a.a殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N-H間形成氫鍵。
目前發(fā)現(xiàn)的β轉(zhuǎn)角多數(shù)在球狀蛋白質(zhì)分子表面,β轉(zhuǎn)角在球狀蛋白質(zhì)中含量十分豐富,占全部殘基的1/4。
β轉(zhuǎn)角的特征:
①由多肽鏈上4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成。
②主鏈骨架以180°返回折疊。
③第一個(gè)a.a殘基的C=O與第四個(gè)a.a殘基的N-H生成氫鍵
④C1α與C4α之間距離小于0.7nm
⑤多數(shù)由親水氨基酸殘基組成。
4、 無(wú)規(guī)卷曲 
沒(méi)有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象。
球狀蛋白中含量較高,對(duì)外界理化因子敏感,與生物活性有關(guān)。
α-螺旋,β-轉(zhuǎn)角,β-折疊在拉氏圖上有固定位置,而無(wú)規(guī)卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。
三、 超二級(jí)結(jié)構(gòu)
由若干個(gè)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元(α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲)組合在一起,彼此相互作用,形成有規(guī)則的、在空間上能夠辨認(rèn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。
1、 αα結(jié)構(gòu)(復(fù)繞α-螺旋)
由兩股或三股右手α-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋,重復(fù)距離140A。
p153 圖3-61  A

存在于α-角蛋白,肌球蛋白,原肌球蛋白和纖維蛋白原中。
2、 βxβ結(jié)構(gòu)
兩段平行式的β-鏈(或單股的β-折疊)通過(guò)一段連接鏈(x結(jié)構(gòu))連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。
①βcβ
         x為無(wú)規(guī)卷曲
p153 圖3-61  B

②βαβ
        x為α-螺旋,最常見(jiàn)的是βαβαβ,稱Rossmann折疊,存在于蘋果酸脫氫酶,乳酸脫氫酶中。
p153 圖3-61  C
3、 β曲折(β-meander)
由三條(以上)相鄰的反平行式的β-折疊鏈通過(guò)緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。

P153圖3-61   D
4、 回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(希臘鑰匙)
P153圖3-61  E
5、 β-折疊桶
由多條β-折疊股構(gòu)成的β-折疊層,卷成一個(gè)筒狀結(jié)構(gòu),筒上β折疊可以是平行的或反平行的,一般由5-15條β-折疊股組成。
超氧化物歧化酶的β-折疊筒由8條β-折疊股組成。筒中心由疏水氨基酸殘基組成。
6、 α-螺旋-β轉(zhuǎn)角-α-螺旋
兩個(gè)α-螺旋通過(guò)一個(gè)β轉(zhuǎn)角連接在一起。
λ噬菌體的λ阻遏蛋白含此結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)與DNA的相互作用中,此種結(jié)構(gòu)占有極為重要的地位。
四、 纖維狀蛋白質(zhì)
纖維狀蛋白質(zhì)的氨基酸序列很有規(guī)律,它們形成比較單一的、有規(guī)律的二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果整個(gè)分子形成有規(guī)律的線形結(jié)構(gòu),呈現(xiàn)纖維狀或細(xì)棒狀,分子軸比(軸比:長(zhǎng)軸/短軸)大于10,軸比小于10是的球狀蛋白質(zhì)。
廣泛分布于脊椎和無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi),占脊椎動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的50%以上,起支架和保護(hù)作用。
1、 角蛋白
源于外胚層細(xì)胞,包括皮膚及皮膚的衍生物(發(fā)、毛、鱗、羽、甲、蹄、角、爪、絲)可分為α-角蛋白和β角蛋白。
(1)、 α-角蛋白
P155 圖3-63,P156  圖3-64
 
主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)組成,三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維,原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱微纖維,成百根微纖維結(jié)合成大纖微
結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性由二硫鍵保證,α-角蛋白在濕熱條件下可伸展轉(zhuǎn)變成β-構(gòu)象,燙發(fā)的化學(xué)機(jī)理Cys含量較高。
?a-角蛋白(a-Keratin)中有兩種類型的多肽鏈:I型和II型。每一個(gè)I型多肽型和一個(gè)II型多肽鏈形成一個(gè)卷曲螺旋二聚體(Coiled coil dimmer)。一對(duì)卷曲螺旋反平行式地形成左手超螺旋結(jié)構(gòu)稱原纖維(Protofilament,4股右手a-螺旋),原纖維的亞基間以氫鍵和二硫鍵相連。4個(gè)原纖維形成微纖維,成百根微纖維形成大纖維,每一個(gè)頭發(fā)細(xì)胸,也將纖維(fiber)含有數(shù)個(gè)大纖維,一根頭發(fā)就是由無(wú)數(shù)的死細(xì)胞相互間以角蛋白相連組成的。?

(2)、 β-角蛋白
P157    圖3-65

含大量的Gly、Ala、Ser,以β-折疊結(jié)構(gòu)為主。
絲心蛋白取片層結(jié)構(gòu),即反平行式β-折疊片以平行的方式堆積成多層結(jié)構(gòu)。鏈間主要以氫鍵連接,層間主要靠范德華力維系。
2、 膠原蛋白
3、 彈性蛋白
4、 肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白
第六節(jié) 球狀蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)與功能
前面講了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的兩個(gè)較低級(jí)的組織水平:一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)(包括超二級(jí)結(jié)構(gòu)),本節(jié)講述蛋白質(zhì)(主要是球蛋白)的高級(jí)結(jié)構(gòu):結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu),及其與生物功能。
一、 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)
蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性和多樣性是建立在結(jié)構(gòu)多樣性的基礎(chǔ)上。
多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)由R基的短程順序決定,當(dāng)一組在肽鏈上相鄰的氨基酸殘基具有適當(dāng)?shù)捻樞驎r(shí),能自發(fā)形成α-螺旋和β-折疊,并處于穩(wěn)定狀態(tài)。
而多肽鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)由氨基酸的長(zhǎng)程順序決定,如產(chǎn)生特異轉(zhuǎn)彎的氨基酸殘基(Pro、Thr、Ser)的精確位置決定多肽鏈轉(zhuǎn)彎形成的方向和角度。
同源蛋白質(zhì)的不變殘基決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。
RNase的變性、復(fù)性實(shí)驗(yàn),證明蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象歸根結(jié)底是復(fù)雜生物大分子的“自我裝配”。

P164  圖3-69  RNase的變性與復(fù)性示意圖二、 球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能
(一) 結(jié)構(gòu)域
結(jié)構(gòu)域(domain),又稱motif(模塊)
在二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊,組裝成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立、近似球形的三維實(shí)體。結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位,多肽鏈折疊的最后一步是結(jié)構(gòu)域間的締合。
對(duì)于較小的蛋白質(zhì)分子或亞基來(lái)說(shuō),結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是一個(gè)意思,就是說(shuō)這些蛋白質(zhì)是單結(jié)構(gòu)域的。
結(jié)構(gòu)域一般有100-200氨基酸殘基,結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連,形成所謂的鉸鏈區(qū),使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。
每個(gè)結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能,幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用,可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。例如,脫氫酶類的多肽主鏈有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,一個(gè)為NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域,一個(gè)是起催化作用的結(jié)構(gòu)域,兩者組合成脫氫酶的脫氫功能區(qū)。
結(jié)構(gòu)域間的裂縫,常是活性部位,也是反應(yīng)物的出入口。一般情況下,酶的活性部位位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的裂縫中。

EF手:鈣結(jié)合蛋白中,含有Helix-Loop-Lelix結(jié)構(gòu)
鋅指:DNA結(jié)合蛋白中,2個(gè)His、2個(gè)Cys結(jié)合一個(gè)Zn
亮氨酸拉鏈:DNA結(jié)合蛋白中,由亮氨酸倒鏈形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu),
圖5.19
(二) 三級(jí)結(jié)構(gòu):
三級(jí)結(jié)構(gòu):整個(gè)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤旋、折疊,形成的特定的整個(gè)空間結(jié)構(gòu)。
或者說(shuō),三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈中所有原子的空間排布。
1、 三級(jí)結(jié)構(gòu)有以下特點(diǎn):
 許多在一級(jí)結(jié)權(quán)上相差很遠(yuǎn)的aa堿基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上相距很近。
‚ 球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí),大部分的水分子從球形蛋白的核心中被排出,這使得極性基團(tuán)間以及非極性基團(tuán)間的相互用成為可能。
ƒ 大的球形蛋白(200aa以上),常常含有幾個(gè)結(jié)構(gòu)域,結(jié)構(gòu)域是一種密實(shí)的結(jié)構(gòu)體,典型情況下常常含有特定的功能(如結(jié)合離子和小分子)
2、 維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力:
P164   圖3-70

(1)氫鍵
大多數(shù)蛋白質(zhì)采取的折疊策略是使主鏈肽基之間形成最大數(shù)目的分子內(nèi)氫鍵(如α-螺旋、β-折疊),同時(shí)保持大部分能成氫鍵的側(cè)鏈處于蛋白質(zhì)分子表面,與水相互作用。
(2)范德華力(分子間及基團(tuán)間作用力)
包括三種弱的作用力:
定向效應(yīng)    極性基團(tuán)間
誘導(dǎo)效應(yīng)    極性與非極性基團(tuán)間
分散效應(yīng)    非極性基團(tuán)間
(3)疏水相互作用
蛋白質(zhì)中的疏水殘基避開(kāi)水分子而聚集在分子內(nèi)部的趨向力。它在維持蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)方面占有突出的地位。
(4)離子鍵(鹽鍵)
是正電賀和負(fù)電荷之間的一種靜電作用。
生理pH下,Asp、Glu側(cè)鏈解離成負(fù)離子,Lys、Arg、His離解成正離子。多數(shù)情況下,這些基團(tuán)分布在球狀蛋白質(zhì)分子的表面,與水分子形成排列有序的水化層。偶爾有少數(shù)帶相反電荷的測(cè)鏈在分子的疏水內(nèi)部形成鹽鍵。
(5)共價(jià)健,主要的是二硫鍵,
在二硫鍵形成之前,蛋白質(zhì)分子已形成三級(jí)結(jié)構(gòu),二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊,三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后,二硫鍵可穩(wěn)定此構(gòu)象。
主要存在于體外蛋白中,在細(xì)胞內(nèi),由于有高濃度的還原性物質(zhì),所以沒(méi)有二硫鍵。
6、靜電相互作用
最強(qiáng)的靜電作用就是帶相反電何的離子基因間的靜電作用,又稱鹽橋。鹽橋和較弱的靜電相互作用(離子-偶級(jí)、偶級(jí)-偶級(jí)、范德華力)也是維持亞基間以及蛋白質(zhì)與配體間的作用力。
3、 免疫球蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)
P193  圖3-99
第七節(jié) 蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、純化、鑒定
一、 蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)
蛋白質(zhì)也是一類兩性電解質(zhì),能和酸、堿發(fā)生作用。
在蛋白質(zhì)分子中,可解離基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán),及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。
P197  表3-16

天然球狀蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)大部分可被滴定,而某些天然蛋白質(zhì)中有一部分可解離基因由于埋藏在分子內(nèi)部或參與氫鍵形成而不能解離。
1、 等電點(diǎn)和等離子點(diǎn)(中性鹽Ca2+、Mg2+、cl、HPO42++)
等電點(diǎn):
P198表3-17  3-18

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關(guān)。
等離子點(diǎn):沒(méi)有其它鹽類干擾時(shí),蛋白質(zhì)質(zhì)子供體解離出的質(zhì)子數(shù)與質(zhì)子受體結(jié)合的質(zhì)子數(shù)相等時(shí)的pH值稱等離子點(diǎn),是每種蛋白質(zhì)的特征常數(shù)。
在等電點(diǎn)條件下,蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度最小,粘度最大。
2、 蛋白質(zhì)的電泳分離
聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE
         SDS-PAGE(荷質(zhì)比相同,分子量不同)
3、 離子交換層析分離蛋白質(zhì)
與氨基酸分離原理相似
二、 蛋白質(zhì)的大小與形狀
測(cè)分子量的方法:
化學(xué)組成法
凝膠過(guò)濾法
SDS-PAGE法
三、 膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀
蛋白質(zhì)分子直徑在1-100nm之間,在水溶液中具有膠體溶液的通性(布朗運(yùn)動(dòng),丁達(dá)耳現(xiàn)象,不能通過(guò)半透膜)
透析:將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋中,置水溶液中,小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來(lái),大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。
蛋白質(zhì)在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)的相對(duì)極性,離子化基因數(shù)量越多,溶解度越大。
1、 穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素
①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜將蛋白質(zhì)顆粒彼此隔開(kāi),不會(huì)互相碰撞凝聚而沉淀。
②兩性電解質(zhì)非等電狀態(tài)時(shí),帶同種電荷,互相排斥不致聚集而沉淀。
一旦電荷被中和或水化膜被破壞,蛋白質(zhì)顆粒聚集,便從溶液中析出沉淀。
2、 沉淀蛋白質(zhì)的方法
①鹽析法  向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4、Na2SO4、Nacl],使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。
②有機(jī)溶劑沉淀法  破壞水化膜,降低介電常數(shù)
③重金屬鹽沉淀
pH大于等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,可與重金屬離子(Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等)結(jié)成不溶性沉淀
④生物堿試劑和某些酸類沉淀法
pH小于等電時(shí),蛋白質(zhì)帶正電荷,易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。
生物堿試劑:是指能引起生物堿沉淀的一類試劑,單寧酸、苦味酸、鎢酸。
酸 類:三氯乙酸、磺基水楊酸。
⑤加熱變性沉淀。
往往是不可逆的。
四、 蛋白質(zhì)的變性
變性作用:理、化因素影響,使蛋白質(zhì)生物活性喪失,溶解度下降,不對(duì)稱性增大及其它理化常數(shù)改變。
(1)變性的因素:
 強(qiáng)酸和強(qiáng)堿;‚ 有機(jī)溶劑,破壞疏水作用;ƒ 去污劑、去污劑都是兩親分子,破壞疏水作用;„ 還原性試劑:尿素、b-硫基乙醇;… 鹽濃度、鹽析、鹽溶;† 重金屬離子,Hg2+、pb2+,能與-SH或帶電基團(tuán)反應(yīng)。‡ 溫度;ˆ 機(jī)械力:如攪拌和研磨中的氣泡。
(2)變性的實(shí)質(zhì):
次級(jí)鍵(有時(shí)包括二硫鍵)被破壞,天然構(gòu)象解體。變性不汲及一級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞。
(3)蛋白質(zhì)變性后,往往出現(xiàn)下列現(xiàn)象:
①結(jié)晶及生物活性喪失是蛋白質(zhì)變性的主要特征。
②硫水側(cè)鏈基團(tuán)外露。
③理化性質(zhì)改變,溶解度降低、沉淀,粘度增加,分子伸展。
④生理化學(xué)性質(zhì)改變。分子結(jié)構(gòu)伸展松散,易被蛋白酶水解。
實(shí)際應(yīng)用:
A.消毒滅菌:75%乙醇,紫外線,高溫。
B.制備活性蛋白質(zhì)時(shí)嚴(yán)防蛋白質(zhì)變性。
(4)變性機(jī)理
①熱變性(往往是不可逆的)多肽鏈?zhǔn)艿竭^(guò)分的熱振蕩,引起氫鏈破壞。
②酸堿變性:破壞了鹽鏈。
③有機(jī)溶劑:破壞水化膜,降低蛋白質(zhì)溶液介電常數(shù)。
(5)可逆變性與不可逆變性
有人認(rèn)為:二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)遭受被破壞即為變性,三級(jí)(或四級(jí))結(jié)構(gòu)被破壞時(shí)引起可逆變性,而二級(jí)及三級(jí)(或四級(jí))結(jié)構(gòu)一并遭破壞時(shí)引起不可逆變性。
五、 分離純化蛋白質(zhì)的主要方法
實(shí)質(zhì):①蛋白與非蛋白分開(kāi),②蛋白質(zhì)之間分開(kāi)
原理:
1. 溶解度差異
PEG沉淀法
有機(jī)溶劑沉淀法
等電點(diǎn)沉淀法
2. 熱穩(wěn)定性差異
熱處理沉淀法
銅鋅SOD(65℃、15分鐘、穩(wěn)定)
3. 電荷性質(zhì)差異
離子交換層析法
電泳法
4. 分子大小和形狀差異
凝膠過(guò)濾、超濾法
透析法、離心法
5. 親和力的差異
親和層析法
某種蛋白質(zhì)能與一種配基特異而非共價(jià)結(jié)合。
配基是指能被生物大分子識(shí)別并與之結(jié)合的原子、原子團(tuán)和分子,如酶的底物、輔酶、調(diào)節(jié)效應(yīng)物及其結(jié)構(gòu)類似物,激素與受體蛋白、抗原與抗體。
分離原理:
P224  圖3-124

u 蛋白質(zhì)毒素
一些致病生物產(chǎn)生的毒素中有很多是蛋白質(zhì)。毒性機(jī)理有: 破壞細(xì)胞膜;‚ 干擾細(xì)胞內(nèi)機(jī)能;ƒ 抑制神經(jīng)細(xì)胞突觸的功能。
直接作用于細(xì)胞膜的毒素稱溶細(xì)胞毒素,可以由細(xì)菌、真菌、植物、魚(yú)、蛇等產(chǎn)生。鏈球菌屬(Streptoccus)Pyogene產(chǎn)生的鏈球菌溶血素(包括0.5等),能使精細(xì)胞產(chǎn)生孔洞,Na+等離子外滲,細(xì)胞死亡。鏈球菌溶血素O是產(chǎn)生風(fēng)濕熱的原因之一(rheiematie fever)。此外,一些有毒的酶點(diǎn),如蛇的磷酯酶在A2也能破壞細(xì)胞膜。
破壞細(xì)胞內(nèi)機(jī)能的毒素也很多,如白候桿菌(Corynebacteriadiphtheriae)產(chǎn)生的白候毒素(diphtheria toxin)和霍亂弧菌(Vibrio cholerae)產(chǎn)生的霍亂毒素(cholera toxin)。它們均由A、B兩個(gè)亞基組成,B亞基與靶細(xì)胞結(jié)合,A亞基致毒。白候毒素分子一旦進(jìn)入靶細(xì)胞,AB亞在就分開(kāi),A亞基是一種酶能阻止蛋白質(zhì)的合成,寄主的心、腎和神經(jīng)組織都會(huì)被破壞。
霍亂毒素的B亞基由5個(gè)相同亞基組成,B亞基與腸細(xì)胞膜結(jié)合,A亞基就被送入這些細(xì)胞中,A亞基激活一種酶使cAMP大量產(chǎn)生,cAMP打開(kāi)細(xì)胞膜的CL通道,由于CL-外泄引起滲適壓的改變,水分也大量喪失,結(jié)果導(dǎo)致腹瀉(diarrhoea),不加治療的話,嚴(yán)重的脫水可使病人48小時(shí)內(nèi)死亡。
神經(jīng)突觸連接兩個(gè)神經(jīng)元或一個(gè)神經(jīng)元與一個(gè)肌肉細(xì)胞。一種毒蛻的產(chǎn)生的毒素a-Latrotoxin(125KD)是一條多肽鏈,能剌激神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(acetylcholine, ACH)的廣譜性釋放酶。肉毒桿菌(Lostrldium botulinum)產(chǎn)生的肉毒桿菌毒素(botulinum toxin)能抑制Ach釋放酶肉毒中毒(botulism)為是由于受了被污染的罐袋食物引起的

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