第四章 酶
酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的高分子生物催化劑。
1957巴斯德提出酒精發(fā)酵是酵母細胞活動的結(jié)果。
1 分子Glc→2分子乙醇+2分子CO2  從Glc開始，經(jīng)過12種酶催化，12步反應(yīng)，生成乙醇。
1897  Buchner兄弟證明發(fā)酵與細胞的活動無關(guān)，不含細胞的酵母汁也能進行乙醇發(fā)酵。
1913  Michaelis和Menten提出米氏學(xué)說—酶促動力學(xué)原理。
1926  Sumner首次從刀豆中提出脲酶結(jié)晶，并證明具有蛋白質(zhì)性質(zhì)。
1969  化學(xué)合成核糖核酸酶。
1967-1970  從E.coli中發(fā)現(xiàn)第I、第II類限制性核酸內(nèi)切酶。
1986  Cech發(fā)現(xiàn)四膜蟲細胞大核期間26S rRNA前體具有自我剪接功能。
ribozyme ，   deoxyribozyme
          E.coRI
                   5’——GAATTC——3’
                   3’——CTTAAG——5’
             限制作用                        修飾作用
        5’——GAATTC——3’           5’——GAATTC——3’
        3’——CTTAAG——5’           3’——CTTAAG——5’
第一節(jié) 酶學(xué)概論
一、 酶的生物學(xué)意義
大腸桿菌生命周期20分鐘，生物體內(nèi)化學(xué)反應(yīng)變得容易和迅速進行的根本原因是體內(nèi)普通存在生物催化劑—酶。沒有酶，生長、發(fā)育、運動等等生命活動就無法繼續(xù)。
限制性核酸內(nèi)切酶（限制-修飾）
二、 酶的概念及其作用特點
1、 酶是一種生物催化劑
酶是一類具有高效率、高度專一性、活性可調(diào)節(jié)的高分子生物催化劑。
生物催化劑 ：酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脫氧核（糖）酶(deoxyribozyme)
2、 酶催化反應(yīng)的特點
（1）、 催化效率高
酶催化反應(yīng)速度是相應(yīng)的無催化反應(yīng)的108-1020倍，并且至少高出非酶催化反應(yīng)速度幾個數(shù)量級。
（2）、 專一性高
酶對反應(yīng)的底物和產(chǎn)物都有極高的專一性，幾乎沒有副反應(yīng)發(fā)生。
（3）、 反應(yīng)條件溫和
溫度低于100℃，正常大氣壓，中性pH環(huán)境。
（4）、 活性可調(diào)節(jié)
根據(jù)據(jù)生物體的需要，許多酶的活性可受多種調(diào)節(jié)機制的靈活調(diào)節(jié)，包括：別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價修飾、酶的合成、活化與降解等。
（5）、 酶的催化活性離不開輔酶、輔基、金屬離子
3、 酶與非生物催化劑相比的幾點共性：
①催化效率高，用量少（細胞中含量低）。
②不改變化學(xué)反應(yīng)平衡點。
③降低反應(yīng)活化能。

P234 圖4-1  非催化過程及催化過程自由能的變化

④反應(yīng)前后自身結(jié)構(gòu)不變。
催化劑改變了化學(xué)反應(yīng)的途徑，使反應(yīng)通過一條活化能比原途徑低的途徑進行，催化劑的效應(yīng)只反映在動力學(xué)上（反應(yīng)速度），不影響反應(yīng)的熱力學(xué)（化學(xué)平衡）。
三、 酶的化學(xué)本質(zhì)
（一） 酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)
經(jīng)典概念：所有的酶都是蛋白質(zhì)，酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)，因此酶具有蛋白質(zhì)的一切共性。
1、 酶的蛋白質(zhì)組成
有些酶僅由蛋白質(zhì)組成，例如，脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等
有些酶不僅含有蛋白質(zhì)（酶蛋白），還含有非蛋白質(zhì)成分（輔助因子），只有酶蛋白與輔助因子結(jié)合形成復(fù)合物（全酶）才表現(xiàn)出酶活性，如超氧化物歧化酶Cu2+、Zn2+）、乳酸脫氫酶（NAD+）
酶的專一性由酶蛋白的結(jié)構(gòu)決定，輔助因子傳遞電子或某些化學(xué)基團。
2、 酶的輔助因子
酶的輔助因子主要有金屬離子（Fe2+、Fe3+ 、Cu+、Cu2+、 Mn2+、、Mn3+、Zn2+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等）和有機化合物。
輔酶：與酶蛋白結(jié)合較松，可透析除去。
輔基：與酶蛋白結(jié)合較緊。

       酶                     輔助因子
CuZn-SOD           Cu2+  Zn2+
Mn-SOD                Mn2+
過氧化物酶              Fe2+或Fe3+
II型限制性核酸內(nèi)切酶    Mg2+
羧肽酶                  Zn2+

P235  表4-1 一些酶的輔助因子（金屬離子）
P237  表4-2  基團反應(yīng)中的輔酶和輔基。

酶蛋白決定酶專一性，輔助因子決定酶促反應(yīng)的類型和反應(yīng)的性質(zhì)。比如，NAD+可與多種酶蛋白結(jié)合，構(gòu)成專一性強的乳酸脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶。
生物體內(nèi)酶種類很多，而輔助因子種類卻很少，原因是一種輔助因子可與多種酶蛋白結(jié)合。
（二） ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）
1980以前，已知所有的生物催化劑，其化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)。
80年代初，美國科羅拉多大學(xué)博爾德分校的Thomas Cech和美國耶魯大學(xué)Sidney Altman各自獨立發(fā)現(xiàn)RNA具有生物催化功能，此發(fā)現(xiàn)被認為是近十年生化領(lǐng)域最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)，此二人分亨1989諾貝爾化學(xué)獎。
ribozyme種類：①自我剪接ribozyme   ②自我剪切ribozyme    ③催化分子間反應(yīng)ribozyme

后邊細講
四、 按酶蛋白的亞基組成及結(jié)構(gòu)特點分類
1、 單體酶
由一條或多條共價相連的肽鏈組成的酶分子
牛胰RNase      124a.a    單鏈
雞卵清溶菌酶    129a.a    單鏈
胰凝乳蛋白酶    三條肽鏈
單體酶種類較少，一般多催化水解反應(yīng)。
2、 寡聚酶
由兩個或兩個以上亞基組成的酶，亞基可以相同或不同，一般是偶數(shù)，亞基間以非共價鍵結(jié)合。
①含相同亞基的寡聚酶
蘋果脫胱氫酶（鼠肝），2個相同的亞基
②含不同亞基的寡聚酶
琥珀酸脫氫酶（牛心），αβ2個亞基
寡聚酶中亞基的聚合，有的與酶的專一性有關(guān)，有的與酶活性中心形成有關(guān)，有的與酶的調(diào)節(jié)性能有關(guān)。
大多數(shù)寡聚酶是胞內(nèi)酶，而胞外酶一般是單體酶。

3、 多酶復(fù)合體
由兩個或兩個以上的酶，靠非共價鍵結(jié)合而成，其中每一個酶催化一個反應(yīng)，所有反應(yīng)依次進行，構(gòu)成一個代謝途徑或代謝途徑的一部分。如脂肪酸合成酶復(fù)合體。
例如：大腸桿菌丙酮酸脫氫酶復(fù)合體由三種酶組成
①丙酮酸脫氫酶（E1）          以二聚體存在2×9600
②二氫硫辛酸轉(zhuǎn)乙�；�酶（E2）  70000
③二氫硫辛酸脫氫酶（E3）      以二聚體存在2×56000

復(fù)合體：12個E1二聚體  24×96000
             24個E2單體    24×70000
             6個E3二聚體   12×56000  
總分子量560萬
4、 多酶融合體
一條多肽鏈上含有兩種或兩種以上催化活性的酶，這往往是基因融合的產(chǎn)物。
例如：天冬氨酸激酶I---高絲氨酸脫氫酶I融合體（雙頭酶）
該酶是四聚體α4，每條肽鏈含兩個活性區(qū)域：N-端區(qū)域是Asp激酶，C端區(qū)域是高Ser脫氫酶。
五、 酶在細胞中的分布
一個細胞內(nèi)含有上千種酶，互相有關(guān)的酶往往組成一個酶體系，分布于特定的細胞組分中，因此某些調(diào)節(jié)因子可以比較特異地影響某細胞組分中的酶活性，而不使其它組分中的酶受影響。
1. 分布于細胞核的酶
核被膜                  酸性磷酸酶
染色質(zhì)                  三磷酸核苷酶
核仁                    核糖核酸酶
核內(nèi)可溶性部分          酵解酶系、乳酸脫氫酶
2. 分布于細胞質(zhì)的酶
參與糖代謝的酶         酵解酶系
                       磷酸戊糖途徑酶系
參與脂代謝的酶         脂肪酸合成酶復(fù)合體
參與a.a蛋白質(zhì)的酶      Asp氨基轉(zhuǎn)移酶
參與核酸合成的酶       核苷激酶  核苷酸激酶
3. 分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酶
       光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)       膽固醇合成酶系
      粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)      蛋白質(zhì)合成酶系
    （細胞質(zhì)一側(cè)）
4. 分布于線粒體的酶
外膜：�；�輔酶A合成酶
內(nèi)膜：NADH脫氫酶
基質(zhì)：三羧酸循環(huán)酶系
      脂肪酸β-氧化酶系
5. 分布于溶酶體的酶
水解蛋白質(zhì)的酶
水解糖苷類的酶
水解核酸的酶
水解脂類的酶
6. 標志酶
有些酶只分布于細胞內(nèi)某種特定的組分中，
核：    尼克酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶，功能：DNA、RNA生物合成
線粒體：琥珀酸脫氫酶（電子轉(zhuǎn)移、三羧酸循環(huán)）
溶酶體：酸性磷酸酶（細胞成分的水解）
微粒體：（核蛋白體、多核蛋白體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）Glc-6-磷酸酶
上清液：乳酸脫氫酶
第二節(jié) 酶的國際分類及命名
一、 習(xí)慣命名
1961年6以前使用的酶沿用習(xí)慣命名
1.（絕大多數(shù)酶）依據(jù)底物來命名
如：催化蛋白質(zhì)水解的酶稱蛋白酶。催化淀粉水解的酶稱淀粉酶。
2. 依據(jù)催化反應(yīng)的性質(zhì)命名
如：水解酶、轉(zhuǎn)氨酶
3 結(jié)合上述兩個原則命名，琥珀酸脫氫酶。
4. 有時加上酶的來源
如：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶
習(xí)慣命名較簡單，但缺乏系統(tǒng)性。
二、 國際系統(tǒng)命名
系統(tǒng)名稱應(yīng)明確標明酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)。
如：草酸氧化酶（習(xí)慣名），系統(tǒng)名稱：    草酸：氧氧化酶
又如：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（習(xí)慣名），系統(tǒng)名：    丙氨酸：α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶
反應(yīng)：丙氨酸+α--酮戊二酸→Glu+丙酮酸
三、 國際系統(tǒng)分類法及編號（EC編號）
原則：將所有酶促反應(yīng)按性質(zhì)分為六類，分別用1、2、3、4、5、6表示。
再根據(jù)底物中被作用的基團或鍵的特點，將每一大類分為若干個亞類，編號用1、2、3……，每個亞類又可分為若干個亞一亞類，用編號1、2、3……表示。
每一個酶的編號由4個數(shù)字組成，中間以“·”隔開。第一個數(shù)字表示大類，第二個數(shù)字表示亞類，第三個表示亞-亞類，第四個數(shù)字表示在亞-亞中的編號。
1、 氧化還原酶類
催化氧化還原反應(yīng)：   A·2H+B=A+B·2H

乳酸：NAD+氧化還原酶（EC1.1.1.27），    習(xí)慣名：乳酸脫氫酶
         圖

2、 轉(zhuǎn)移酶類
AB+C=A+BC
Ala：酮戊二酸氨基移換酶（EC2.6.1.2），    習(xí)慣名： 谷丙轉(zhuǎn)氨酶
         圖
3、 水解酶類
催化水解反應(yīng)，包括淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶。
亮氨酸氨基肽水解酶（EC3.4.1.1），    習(xí)慣名：  Ile氨肽酶。
4、 裂合酶類（裂解酶）
催化從底物上移去一個基團而形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)
二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），     習(xí)慣名：醛縮酶
5、 異構(gòu)酶（EC5.3.1.9）
催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化，6-磷酸Glc異構(gòu)酶
6、 合成酶（連接酶）
催化一切必須與ATP分解相偶聯(lián)、并由兩種物質(zhì)合成一種物質(zhì)的反應(yīng)。

P241 表4-8 酶的國際分類——大類和亞類

舉例：乙醇脫氫酶的分類編號是 EC1.1.1.1 ，乳酸脫氫酶EC1.1.1.27 ， 蘋果酸脫氫酶EC1.1.1.37

第一個數(shù)字表示大類：    氧化還原
第二個數(shù)字表示反應(yīng)基團：醇基
第三個數(shù)字表示電子受體：NAD+或NADP+
第四個數(shù)字表示此酶底物：乙醇，乳酸，蘋果酸。
前面三個編號表明這個酶的特性：反應(yīng)性質(zhì)、底物性質(zhì)（鍵的類型）及電子或基團的受體，第四個編號用于區(qū)分不同的底物。

酶的物種和組織的差異
來自不同物種或同一物種不同組織或不同細胞器的同一種酶，雖然它們催化同一個生化反應(yīng)，但它們的一級結(jié)構(gòu)可能不相同，有時反應(yīng)機制也可能不同，可是無論是酶的系統(tǒng)命名法還是習(xí)慣命名法，對這些均不加以區(qū)別，而定為相同的名稱，這是因為命名酶的根據(jù)是酶所催化的反應(yīng)。
例如，  SOD不管來源如何，均催化如下反應(yīng)
2O2-+2H+→H2O2+O2    H2O2再由過氧化氫酶催化、分解
它們有同一個名稱和酶的編號EC1.15.1.1
實際此酶可分三類：
CuZn-SOD   真核生物細胞質(zhì)中
Mn-SOD     真核生物線粒體中
Fe-SOD
即使同是CuZn-SOD，來自牛紅細胞與豬紅細胞的，其一級結(jié)構(gòu)也有很大不同。
因此，在討論一個具體的酶時，應(yīng)對它的來源與名稱一并加以說明。
第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué)
酶促反應(yīng)動力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶促反應(yīng)速度的各種因素，包括低物濃度、酶濃度、pH、溫度、激活劑與抑制劑、等。
一、 酶的量度
酶的含量不能直接用重量和摩爾數(shù)表示（不純、失活、分子量不知），而采用酶的活力單位表示
1、 酶活力與酶促反應(yīng)速度
酶活力：用在一定條件下，酶催化某一反應(yīng)的反應(yīng)速度表示。反應(yīng)速度快，活力就越高。
酶量—酶活力一反應(yīng)速度
酶促反應(yīng)速度的表示方法：單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。
單位：濃度/單位時間

      P243  圖4-4  酶反應(yīng)速度曲線

研究酶促反應(yīng)速度，以酶促反應(yīng)的初速度為準。因為底物濃度降低、酶部分失活產(chǎn)物抑制和逆反應(yīng)等因素，會使反應(yīng)速度隨反應(yīng)時間的延長而下降。
2、 酶的活力單位（U）
國際酶學(xué)會標準單位：在特定條件下，1分鐘內(nèi)能轉(zhuǎn)化1umol底物的酶量，稱一個國際單位（IU）。特定條件：25℃ pH及底物濃度采用最適條件（有時底物分子量不確定時，可用轉(zhuǎn)化底物中1umol的有關(guān)基團的酶量表示）。
實際工作中，每一種酶的測活方法不同，對酶單位分別有一個明確的定義。
如 ：限制性核酸內(nèi)切酶
用粘度法測活性：定義為30℃， 1分鐘，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量為1個酶單位。
轉(zhuǎn)化率法：標準條件，5分鐘使1ug供體DNA殘留37%的轉(zhuǎn)化活性所需的酶量為1個酶單位。
凝膠電泳法測活：37℃，1小時，使1ugλDNA完全水解的酶量為1個酶單位。
可見，同一種酶采用不同的測活方法，得到的酶活單位是不同的，即使是同一種測活法，實驗條件稍有相同，測得的酶單位亦有差異。
如 淀粉酶，兩種定義
A：1 g可溶性starch，在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。
B：l ml 2%可溶性starch ，在1h內(nèi)液化所需的enzyme量。
1g 酶制劑溶于1000ml H2O，取0.5ml與2%的starch 20ml反應(yīng)，pH6.0，10分鐘完全液化，求酶活力。
A：60/10×20×2%×1/0.5×1000=4800u/克enzyme制劑
B：60/10×20/0.5×1000=240000u/克enzyme制劑
3、 酶的比活力  Specific  activity
每毫克酶蛋白所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的純度是重要指標。
單位：U/mg蛋白質(zhì)。
有時用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少個活力單位表示。

舉例：一個酶的分離純化分為4 步。
步驟             1       2       3       4
總活力（U）      6       4       3       2
總蛋白質(zhì)（mg）  20      10       5       2
比活力（U/mg）  6/20    4/10     3/5      2/2

酶的提純過程中，總蛋白減少，總活力減少，比活力增高。

酶的純化倍數(shù)：

酶的回收率：                    ×100%
4、 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)和催化周期
分子活性定義：每mol的 enzyme  在1秒內(nèi)轉(zhuǎn)化substrate的 mol數(shù)。
亞基或催化中心活性定義：每mol 的active subunit或 active center 在一秒內(nèi)轉(zhuǎn)化的substrate 的mol 數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)Kcat
P244圖表4—4

轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個酶分子每催化一個底物分子所需的時間。
如：乳糖脫氫酶轉(zhuǎn)換數(shù)為1000/秒，則它的催化周期為10-3秒。

二、 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響
單底物酶促反應(yīng)，包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合催化的反應(yīng)。
1913 Michaelis 和Menten 提出米—曼方程。
（一） 底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響——米式學(xué)說的提出
1903  Henri    研究蔗糖水解反應(yīng)。
                         
         sucrose +H2O        acid       glucose +fructose
                          sucrase

酸水解
        V                      V         
                                      
  
   [sucrose] 
                                           
    酶水解          
                                          V
        V                                

     [enzyme]( substrate不變)                     [sucrose] 
底物濃度與酶促反應(yīng)速度的關(guān)系：

當?shù)孜餄舛炔粩嘣龃髸r，反應(yīng)速度不再上升，趨向一個極限，酶被底物飽和（底物飽和現(xiàn)象）。
中間產(chǎn)物假說：酶與底物先絡(luò)合成一個中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。
證據(jù)：（1）競爭性抑制實驗（2）底物保護酶不變性（3）結(jié)晶ES復(fù)合物的獲得。
米式學(xué)說：
1913年，Michaelis和Menten繼承和發(fā)展了中間產(chǎn)物學(xué)說，在前人工作基礎(chǔ)上提出酶促動力學(xué)的基本原理，并以數(shù)學(xué)公式表明了底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系，稱米式學(xué)說：

（二） 米式方程的導(dǎo)出：
1、 基于快速平衡假說——早年的米式方程
最初，Michaelis和Menten是根據(jù)“快速平衡假說”推出米式方程。
快速平衡假說：

① 在反應(yīng)的初始階段，底物濃度遠遠大于酶濃度，因此，底物濃度{S}可以認為不變。
② 游離的酶與底物形成ES的速度極快，E + S       ES，而ES形成產(chǎn)物的速度極慢，ES分解成產(chǎn)物P對于[ES]濃度的動態(tài)平衡沒有影響，不予考慮。
K1、K2》K3
③ 因為研究的是初速度，P的量很小，由P        ES可以忽略不記。

ES的生成速度：K1（[E] - [ES]）[S]
ES的分解速度：K2[ES]
K1（[E] - [ES]）[S]  =  K2[ES]

反應(yīng)速度：

KS現(xiàn)在稱為底物常數(shù)
2、 Briggs和Haldane的“穩(wěn)態(tài)平衡假說”及其對米式方程的發(fā)展：
穩(wěn)態(tài)平衡假說：

[ES]的的生成與分解處于動態(tài)平衡（穩(wěn)態(tài)），有時必須考慮[ES]分解成產(chǎn)物P對于[ES]動態(tài)平衡的影響（[ES]分解速度）�；蛘哒f，[ES]的動態(tài)平衡（分解速度）不僅與ES        E+S有關(guān)，還與ES         P + E有關(guān)。
穩(wěn)態(tài)平衡假說的貢獻在于第②點。

用穩(wěn)態(tài)假說推導(dǎo)米式方程：
ES生成速度：
k1（[E] - [ES]）[S]
ES分解速度：
k2[ES]+k3[ES]
以上兩個速度相等。
k1（[E] - [ES]）[S] = k2[ES]+k3[ES]

反應(yīng)速度：

Vmax=k3 [E]
Km稱米氏常數(shù)，當Km及Vmax已知時，即可確定酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系。
（三） 米式方程討論
1、 快速平衡假說與穩(wěn)態(tài)平衡假說的實質(zhì)區(qū)別

當K1、K2＞＞K3時，即ES       P是整個反應(yīng)平衡中極慢的一步，那么

這就是早年提出的米式方程
因此說，穩(wěn)態(tài)平衡 = 快速平衡 + 慢速平衡，

當ES         P（即K3/K1）極慢時，穩(wěn)態(tài)平衡基本等于快速平衡
2、 Km的物理意義
當反應(yīng)速度v=1/2 Vmax時， Km = [S]，
Km的物理意義是：當反應(yīng)速度達到最大反應(yīng)速度的一半時底物的濃度。
單位：與底物濃度的單位一致，mol·L-1或mmol·L-1
Km是酶的特征常數(shù)之一。一般只與酶的性質(zhì)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。不同的酶Km值不同。

  P248  表4-5  一些酶的Km值。
3、 Km與天然底物
如果一個酶有幾種底物，則每一種底物各有一個特定的Km，其中Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物。因為Km愈小（達到Vmax一半所需的底物濃度愈�。┍硎綱變化越靈敏底物。

4、 Km、Ks與底物親和力
Km稱米式常數(shù)，Km=（K2+K3）／K1 ，從某種意義上講，Km是ES分解速度（K2+K3）與形成速度（K1）的比值，它包含ES解離趨勢（K2／K1）和產(chǎn)物形成趨勢（K3／K1）。
Ks稱為底物常數(shù)，Ks=K2／K1，它是ES的解離常數(shù)，只反映ES解離趨勢，因此，1/Ks可以表示酶與底物的親和力大�。‥S形成趨勢），不難看出，底物親和力大不一定反應(yīng)速度大（產(chǎn)物形成趨勢，K3／K1）
只有當K2、K1＞＞K3時，Km≈Ks，因此，1/Km只能近似地表示底物親和力的大小。
問題：
（1） Km越小，底物親和力越大（X）
（2） Ks越小，底物親和力越大（√）
（3） 天然底物就是親和力最大的底物（X）
（4） 天然底物就是Km值最小的底物（√）

5、 Km與米式方程的實際用途
已知V求[S]
已知[S]求V
相對速度（酶活性中心被占據(jù)分數(shù)Y）：

當v=Vmax時，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)，v與[S]無關(guān)，只和[Et]成正比。當v=1/2 Vmax時，表示活性部位有一半被占據(jù)。
設(shè)定達到最大反應(yīng)速度的0.9倍時，所需底物濃度為[S]0.9
[S]0.9=9Km
同理有：[S]0.8=4Km
              [S]0.7=2.33Km
              [S]0.6=1.5Km
              [S]0.5=1Km
              [S]0.1=1/9Km
[S]0.9 /[S]0.1=81
[S]0.7/[S]0.1=21

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