Angerer及其同事們首先應用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984)，核酸探針為單鏈的RNA分子，產(chǎn)生自具有質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的cDNA克隆（圖20-2)。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會再退火（reanneal)，因此，較大百分比的探針可參與雜交反應，較cDNA探針的信號強。除此之外，在溶液中產(chǎn)生的cRNA-mRNA雜交體比相應的cDNA-mRNA雜交體穩(wěn)定，但在原位雜交中是否如此尚未證明。cRNA探針不足之處在于有時比DNA探針粘性強（stickier)�？膳c組織產(chǎn)生較高的非特異性結合，但此缺陷可在雜交后漂洗液中加用酶漂洗來解決。最近，Wolf等（1987)建議插入確定長度的寡核苷酸至載體內(nèi)產(chǎn)生cRNA分子，這種cRBA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”（oligoribo－probes)已被成功的用于原位雜交實驗。
圖20-2 示cDNA轉(zhuǎn)錄為cRNA，可標記以不同的標記物，然后與細胞中
的mRNA相結合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛)
一、同位素標記cRNA探針在ISHH中的應用
（一)組織切片的原位雜交細胞化學方法
�。�1)組織準備：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 體重)，或1%戊巴比妥鈉約1ml（3～4mg/100g體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，用100ml生理鹽水沖洗和150ml 4%多聚甲醛主動脈灌注固定。固定半小時后，取出組織塊，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。醫(yī)學.全.在線.網(wǎng).站.提供
如要取腦組織，可于灌注后置4℃冰箱內(nèi)過夜，次晨取腦組織，后固定4℃4h左右。
�。�2)組織切片/培養(yǎng)細胞在經(jīng)過處理，抹以粘附劑的載片上，在43℃烤箱過夜。
（3)在PBS（0.1mol/l Ph7.2)中浸5～10min。
�。�4)浸于0.1mol/L甘氨酸—PBs 液內(nèi)5min。
�。�5)為增強組織通透性，將載片置于0.3%Triton X-100(在PBS內(nèi))10～15min。
�。�6)PBS洗3×5min。
（7)在蛋白激酶K（1μg/ml)溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8)中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
（8)浸入新鮮配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2)3min以終止消化作用和再固定。
（9)浸入新鮮配制的含0.25%（V/V)三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0)中，10min以達乙酰化（acetylate)的目的。
（10)預雜交：在50%（V/V)甲酰胺溶于4×SSC預熱37℃15～45min 。
�。�11)雜交：將載片上過量的甲酰胺液傾去，加20μl雜交混合液（含放射性同位素標記的探針量為5×103～106cpm/每張載片)。覆以硅化的蓋玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒內(nèi)以保持濕度，42℃孵育12～18h。為使載片不致于浸泡于SSC溶液內(nèi)，通常以二根玻管（或棒)扎成擔架狀，載片置于玻棒上，與鹽液不接觸，但可保持盒內(nèi)空氣濕潤。
（12)雜交后漂洗
�、僖孕⑦m量4×SSC溶液，將載片一端斜插入溶液內(nèi)，輕輕抖動以移除蓋玻片。
�、趯⑤d片置于有刻度的染色用小方玻缸內(nèi)，加入42℃（預熱)4×SSC，3×20min。在漂洗過程中宜不斷振動，以增強漂洗效果。如設有調(diào)整鈕的振動臺更為理想。
�、奂�20μlRNA酶溶液（20μg/ml)在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0)消化未雜交探針，42℃30min（也有不加EDTA的)。
�、芤赃f減梯度鹽溶液SSC漂洗載片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
�、萏荻染凭�脫水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室溫，每次10min，空氣干燥后待進行放射自顯影。
（13)放射自顯影和復染
�、僭诎凳抑蓄A熱水浴至45℃，將分裝的核乳膠溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同時預熱一電熱板至45℃。將雜交后漂洗過完全干燥的載片依次排列于玻片架上，有組織切片一面面向?qū)嶒炚�。在實驗的載玻片前放1～2張無切片的干凈玻片，作為測定核乳膠溶解度與浸片高度等的空白對照片。浸泡（Dipping)過核乳膠膜的載片放入暗盒內(nèi)，事先最好將暗盒準備好，為保持干燥，放入一包變色硅膠干燥劑（無水干燥劑為小塊藍色晶體，吸水后呈粉紅色，置烤箱中烘干待轉(zhuǎn)成藍色后可重復應用)，預先備好封固暗盒用的膠帶備用。
�、诤巳槟z液，國外產(chǎn)品為ILFord K5乳膠液，國內(nèi)核乳膠產(chǎn)品可自原子能研究所訂購。不論國產(chǎn)或進口乳膠，事先應（按說明需要濃度)稀釋分裝在10ml小瓶內(nèi)，密封于暗盒內(nèi)，4℃?zhèn)溆�。反復的冷凍和融解核乳膠會增加背景染色。每一小瓶供一次性實驗應用。
為節(jié) 省核乳膠，切片宜貼附在靠近載片的一端。這樣，在浸泡時少量乳膠便可充分覆蓋切片。
�、劢巳槟z（Dipping)：當一切準備工作就緒后，在暗室中（只留完全燈)先將載片置于電熱板上預熱1～2min。以空白載片浸入核乳膠液，取出后檢查核乳膠是否充分溶解，玻片上有無氣泡。然后正式進行切片浸入。浸核乳膠膜是一項需反復操練的技術。以拇、食指夾住玻片一端，以垂直方向進入乳膠，進入的提出均應采取中速度，且速度應保持穩(wěn)定，提出后可將玻片一端滴下的乳膠輕沾于吸水紙上，掌握好該技術，浸入形成的核乳膠膜厚度適當，均勻一致。依序放在預熱45℃的電熱板，傾斜度應一致。在45℃電熱板上干燥至少1～2h，在此期間應嚴格控制在黑暗中。
�、苎b入暗盒曝光：將載片架上已干燥覆有核乳膠的載片放入暗盒內(nèi)，周圍用膠帶封固，以標簽寫明：樣品種類，實驗者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱內(nèi)。曝光時間依同位素種類而異，32P大約需5～7日，3H需4周，但還要參考細胞內(nèi)mRNA的含量而定，含量高者曝光時間宜短，反之宜適當延長。可根據(jù)不同曝光時間的實驗結果予以調(diào)整。曝光時間長可增加信號，但也增加背景，反之，信號減弱，但背景亦低。
�、蒿@影：取出切片中暗盒（注意：切勿啟封)，放在室溫至少1h，使其回升到室溫。然后在暗室內(nèi)（只留安全燈)，將載片置入Kodax D19顯影液（預調(diào)溫至18～20℃)3min。水沖片刻后入Kodax F24固定劑內(nèi)3min。上述溶液及水溫最好都保持在18～20℃。突然改變?nèi)芤簻囟葧䲟p壞精細的核乳膠膜。另外，在顯影和定影過程中不要振蕩溶液，因為，這時的乳膠還是處于膠狀結構，溶液振蕩的沖擊可使乳膠膜產(chǎn)生劃痕。
�、逈_洗，脫水和復染：用自來水（水沖力勿過猛)沖洗載片20min，如需要可用1%蘇木精復染，復染后自來水沖洗分化2min，梯度酒精脫水（70%，90%，100%)每次3min，二甲苯透明，DPX封片。
