豬圓環(huán)病毒感染診斷方法
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豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus ，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒。該病毒粒子直徑為14 nm～25 nm，為二十面體對稱結(jié)構(gòu)，無囊膜，是獸醫(yī)學(xué)上已知?jiǎng)游锊《局凶钚〉牟《局�。根�?jù)PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，將其分為PCV-1和PCV-2兩型。有關(guān)PCV引起疾病的最早報(bào)道發(fā)生在1991年的加拿大，是由PCV-2引起的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)。至1994年P(guān)MWS已呈廣泛性流行，法國、美國、西班牙、北愛爾蘭及日本相繼報(bào)道了該病的發(fā)生，此后韓國、意大利、德國、丹麥、荷蘭、墨西哥等國家也證實(shí)了該病的存在。我國雖然自2000年才有對圓環(huán)病毒感染豬的報(bào)道并引起重視，但對于
豬血清中豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體所作的回顧性檢測以及對豬的組織樣本所作的回顧性檢測結(jié)果表明，PCV-2抗體至少從1969年起就已經(jīng)存在于豬群中了。臨床上豬感染PCV-1很常見，普遍認(rèn)為廣泛存在于豬體內(nèi)及豬源傳代細(xì)胞系，由于其無致病性，所以無法通過臨床癥狀或病理診斷來確定是否感染PCV-1。但PCV-2與豬群中發(fā)生的多種疾病相關(guān)，有其相應(yīng)的臨床癥狀和病理表現(xiàn)，在臨床上主要引起PMWS、豬皮炎
腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、豬呼吸道疾病復(fù)合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)及A2型先天性
震顫(Congenital tremor，CT)。PCV-2與豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、
豬流感病毒(Swine influenza virus，SIV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)等病原可以混合感染，致病性增強(qiáng)。本文綜述了豬圓環(huán)病毒診斷學(xué)方法的研究進(jìn)展，以供借鑒。 1 豬圓環(huán)病毒感染的臨床診斷 豬感染PCV-2后主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性消瘦，生長遲緩，采食量下降，被毛粗亂，精神差，相當(dāng)一部分豬只出現(xiàn)呼吸困難呈腹式呼吸，少數(shù)豬只有拉稀癥狀，有的豬出現(xiàn)貧血，個(gè)別豬出現(xiàn)
黃疸癥狀；PCV-2感染豬引起的CT，震顫為雙側(cè)，影響骨骼肌肉，當(dāng)臥下或睡覺時(shí)震顫消失，外界刺激可引發(fā)或加重震顫，有的在整個(gè)生長和發(fā)育期間都不斷發(fā)生震顫；PCV-2感染豬引起PDNS的臨床癥狀常見為皮膚發(fā)生圓型或不規(guī)則的隆起，呈現(xiàn)紅色或紫色中央為黑色病灶。 2 豬圓環(huán)病毒感染的病理學(xué)診斷 豬感染PCV-2后，最顯著的剖檢病變是全身淋巴結(jié)，特別是腹股溝淋巴結(jié)、縱隔淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)及下頜淋巴結(jié)腫大2倍～5倍，有時(shí)可達(dá)10倍；
肺臟腫脹、堅(jiān)硬或似橡皮，部分病例形成固化、致密的病灶。嚴(yán)重病例肺泡出血，肺呈紫褐色，有的肺尖葉和心葉萎縮或?qū)嵸|(zhì)性病變；半數(shù)病例為輕度到中度的肝萎縮，花斑肝。肝小葉間結(jié)締組織增生明顯；脾臟常腫大，呈肉樣變化；腎為花斑腎，
水腫，呈灰白色，被膜下有時(shí)有白色壞死灶；胃的食管部黏膜水腫和非出血性潰瘍；回腸和結(jié)腸段腸壁變薄，
盲腸和結(jié)腸黏膜充血和出血。另外，經(jīng)常見到由繼發(fā)感染引起的
胸膜炎、腹膜炎、
心包炎(心包膜內(nèi)有大量炎性滲出物)和關(guān)節(jié)炎。當(dāng)發(fā)現(xiàn)豬全身淋巴結(jié)腫大，肺退化不全或形成固化、致密病灶時(shí)，應(yīng)懷疑為PCV-2感染。如病理組織學(xué)檢查可見全身淋巴組織的
淋巴細(xì)胞減少，單核巨噬細(xì)胞浸潤及形成多核巨細(xì)胞，并在這些細(xì)胞中觀察到嗜堿性或兩性染色的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)包涵體，則基本可以確診。 3 豬圓環(huán)病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷 3.1 電鏡法 利用電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒，根據(jù)病毒本身所具有的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征，可即刻做出診斷。Stevenson首次在透射電鏡下對被PCV-2持續(xù)感染的PK-15細(xì)胞內(nèi)的PCV-2進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的觀察，并詳細(xì)描述了在細(xì)胞的細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)的病毒包涵體及病毒粒子的形態(tài)。郎洪武從發(fā)病豬的脾臟和淋巴結(jié)組織的超薄切片中觀察到了大量直徑17 nm、圓形、無囊膜的PCV病毒粒子。 3.2 免疫組織化學(xué)檢測技術(shù) Sorden等采用純化的PCV-2抗原免疫
兔子，得到兔抗PCV-2高免血清。利用此高免血清結(jié)合福爾馬林固定石蠟包埋組織中的PCV-2抗原，再采用生物素標(biāo)記的抗兔二抗與
兔血清結(jié)合，最后用過氧化物酶標(biāo)記的
鏈霉素染色。他們應(yīng)用此法發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞內(nèi)存在大量濃染的圓形結(jié)構(gòu)，大小和形狀與包涵體相似。Chianini等也用兔抗PCV-2的陽性血清建立了免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry)檢測技術(shù)。Magar等為了克服內(nèi)源性過氧化物酶對檢測結(jié)果的影響，將過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體改用免疫膠體銀標(biāo)記，取得了更好的檢測效果。 3.3 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence assay，IFA)可用于PCV的抗體檢測及抗原組織定位的研究。Allan利用接免疫熒光來檢測PCV，就是將組織病料以蓋玻片在PK-15細(xì)胞中培養(yǎng)，丙酮固定，用兔抗PCV高免血清與細(xì)胞培養(yǎng)物中的PCV 反應(yīng)，可對PCV 進(jìn)行檢測和分型。崔尚金等 將接種PCV-2且經(jīng)多次傳代的PK-15細(xì)胞分散到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，制成抗原診斷板，檢測血清中PCV-2的抗體�，F(xiàn)在一般認(rèn)為IFA是實(shí)驗(yàn)室檢測PCV-2的一種快速、靈敏、成本低的方法，但操作上較復(fù)雜，不宜作為臨床快速診斷。 3.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)可以檢測抗體，也可以檢測抗原，具有靈敏、簡單、快捷的特點(diǎn)。采用Walker等的競爭ELISA來檢測PCV-2抗體，此法的檢出率為99.58%。Allan等也利用單抗建立了抗原捕獲ELISA來檢測PCV-2特異性抗體。琚春梅等 利用PCV-2-ORF2基因原核表達(dá)產(chǎn)物建立了ELISA檢測方法。崔尚金等 以重組桿狀病毒表達(dá)PCV衣殼蛋白作為ELISA抗原，提高了HRP標(biāo)記的二抗的稀釋倍數(shù)，降低了背景的非特異性。林彥星等 應(yīng)用原核表達(dá)的PCV-2 Cap蛋白建立了間接ELISA。張曉勇等 利用巴斯德畢赤酵母高效表達(dá)PCV-2-ORF2基因編碼蛋白建立了。 (
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根據(jù)臨床癥狀
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實(shí)驗(yàn)室檢查
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