生物化學(xué)與分子生物學(xué):第一節(jié)　DNA的復(fù)制

DNA做為遺傳物質(zhì)的基本特點(diǎn)就是在細(xì)胞分裂前進(jìn)行準(zhǔn)確地自我復(fù)制(self�瞨eplication)，使DNA的量成倍增加，這是細(xì)胞分裂的物質(zhì)基礎(chǔ)。1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型指出，DNA是由二條互補(bǔ)的脫氧核苷酸鏈組成，所以一條DNA鏈上的核苷酸排列順序是由圖16-1雙螺旋DNA的復(fù)制另一條決定的。這就說明DNA的復(fù)制是由原來存在的分子為模板來合成新的鏈。曾經(jīng)有過多種關(guān)于DNA復(fù)制方式的學(xué)說，包括半保留復(fù)制，全保留復(fù)制以及分散復(fù)制等(圖16-1)。

圖16－1　雙螺旋DNA的復(fù)制

一、DNA復(fù)制的方式及一般過程：

(一)DNA的半保留復(fù)制(semiconservative replication)

Watson和Crick在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)即推測，DNA在復(fù)制時(shí)首先兩條鏈之間的氫鍵斷裂兩條鏈分開，然后以每一條鏈分別做模板各自合成一條新的DNA鏈，這樣新合成的子代DNA分子中一條鏈來自親代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模�這種復(fù)制方式為半保留復(fù)制。

1958年Meselson和Stahl利用氮標(biāo)記技術(shù)在大腸桿菌中首次證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制，他們將大腸桿菌放在含有15N標(biāo)記的NH4Cl培養(yǎng)基中繁殖了15代，使所有的大腸桿菌DNA被15N所標(biāo)記，可以得到15N桪NA。然后將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到含有14N標(biāo)記的NH4Cl培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)不同代數(shù)時(shí)，收集細(xì)菌，裂介細(xì)胞，用氯化銫(CsCl)密度梯度離心法觀察DNA所處的位置。由于15N桪NA的密度比普通DNA(14N－DNA)的密度大，在氯化銫密度梯度離心(density gradientcentrifugation)時(shí)，兩種密度不同的DNA分布在不同的區(qū)帶。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在全部由15N標(biāo)記的培養(yǎng)基中得到的15N桪NA顯示為一條重密度帶位于離心管的管底。當(dāng)轉(zhuǎn)入14N標(biāo)記的培養(yǎng)基中繁殖后第一代，得到了一條中密度帶，這是15N桪NA和14N-DNA的雜交分子。第二代有中密度帶及低密度帶兩個(gè)區(qū)帶，這表明它們分別為15N14N－DNA和14N14N-DNA。隨著以后在14N培養(yǎng)基中培養(yǎng)代數(shù)的增加，低密度帶增強(qiáng)，而中密度帶逐漸減弱，離心結(jié)束后，從管底到管口，CsCl溶液密度分布從高到低形成密度梯度，不同重量的DNA分子就停留在與其相當(dāng)?shù)腃sCl密度處，在紫外光下可以看到DNA分子形成的區(qū)帶。為了證實(shí)第一代雜交分子確實(shí)是一半15N-DNA－半14N－DNA，將這種雜交分子經(jīng)加熱變性，對(duì)于變性前后的DNA分別進(jìn)行CsCl密度梯度離心，結(jié)果變性前的雜交分子為一條中密度帶，變性后則分為兩條區(qū)帶，即重密度帶(15N－DNA)及低密度帶(14N－DNA)。它們的實(shí)驗(yàn)只有用半保留復(fù)制的理論才能得到圓滿的解釋(圖16－2和16-3)。

圖16-2　DNA的半保留復(fù)制第一代分子含有一條親代的鏈(用黑色素示)，與另一條新合成的鏈(用白色表示)配對(duì)。在以后的連續(xù)復(fù)制過程中，原來親代的兩條鏈仍然保持完整，因此總有兩個(gè)分子各具有一條原來親代的鏈。	圖16-3　DNA的半保留復(fù)制－Meslson�睸tahl實(shí)驗(yàn)密度梯度離心后的DNA位置：左三管為對(duì)照；右三管為實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(二)DNA復(fù)制的一般過程：

DNA雙螺旋是由兩條方向相反的單鏈組成，復(fù)制開始時(shí)，雙鏈打開，形成一個(gè)復(fù)制叉(replicative fork,從打開的起點(diǎn)向一個(gè)方向形成)或一個(gè)復(fù)制泡(replicative bubble，從打開的起點(diǎn)向兩個(gè)方向形成。)兩條單鏈分別做模板。各自合成一條新的DNA鏈。由于DNA一條鏈的走向是5′→3′方向，另一條鏈的走向是3′→5′方向，但生物體內(nèi)DNA聚合酶只能催化DNA從5′→3′的方向合成。那么，兩條方向不同的鏈怎樣才能做模板呢?這個(gè)問題由日本學(xué)者崗崎先生解決。

原來，在以3′→5′方向的母鏈為模板時(shí)，復(fù)制合成出一條5′→3′方向的前導(dǎo)鏈(leadingstrand)，前導(dǎo)鏈的前進(jìn)方向與復(fù)制叉打開方向是一致的，因此前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而另一條母鏈DNA是5′→3′方向，它作為模板時(shí)，復(fù)制合成許多條5′→3′方向的短鏈，叫做隨從鏈(lagging strand)，隨從鏈的前進(jìn)方向是與復(fù)制叉的打開方向相反的。隨從鏈只能先以片段的形式合成，這些片段就叫做崗崎片段(Okazaki fragments)，原核生物崗崎片段含有1000-2000核苷酸，真核生物一般100?00核苷酸。最后再將多個(gè)崗崎片段連接成一條完整的鏈。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以從總體上看DNA的復(fù)制是半不連續(xù)復(fù)制(圖16-4)。

圖16－4　DNA的半不連續(xù)復(fù)制

DNA復(fù)制的全部過程可以人為地分成三個(gè)階段，第一個(gè)階段為DNA復(fù)制的起始階段，這個(gè)階段包括起始點(diǎn)，復(fù)制方向以及引發(fā)體的形成，第二階段為DNA鏈的延長，包括前導(dǎo)鏈及隨從鏈的形成和切除RNA引物后填補(bǔ)空缺及連接崗崎片段。第三階段為DNA復(fù)制的終止階段。在DNA復(fù)制的整個(gè)過程中需要30多種酶及蛋白質(zhì)分子參加，我們將在DNA復(fù)制的各個(gè)階段中著重介紹它們的作用。

二、DNA復(fù)制的起始階段：

(一)DNA復(fù)制的起始點(diǎn)

很多實(shí)驗(yàn)都證明：復(fù)制是從DNA分子上的特定部位開始的，這一部位叫做復(fù)制起始點(diǎn)(originof replication)常用ori或o表示。細(xì)胞中的DNA復(fù)制一經(jīng)開始就會(huì)連續(xù)復(fù)制下去，直至完成細(xì)胞中全部基因組DNA的復(fù)制。DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始直到終點(diǎn)為止，每個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。在原核細(xì)胞中，每個(gè)DNA分子只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因而只有一個(gè)復(fù)制子，而在真核生物中，DNA的復(fù)制是從許多起始點(diǎn)同時(shí)開始的，所以每個(gè)DNA分子上有許多個(gè)復(fù)制子。

DNA復(fù)制起始點(diǎn)有結(jié)構(gòu)上的特殊性，例如：大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始點(diǎn)Oric由422個(gè)核苷酸組成，是一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，其中有9個(gè)核苷酸或13個(gè)核苷酸組成的保守序列，這些部位是大腸桿菌中DnaA蛋白識(shí)別的位置，大腸桿菌染色體DNA是環(huán)狀雙鏈DNA，它的復(fù)制是典型的“θ”型復(fù)制(由于形狀像希臘字母θ)。從一個(gè)起點(diǎn)開始，同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制，當(dāng)兩個(gè)復(fù)制方向相遇時(shí)，復(fù)制就停止。而有些生物的DNA復(fù)制起始區(qū)是一段富含A·T的區(qū)段。這些特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于在DNA復(fù)制起始過程中參與的酶和許多蛋白質(zhì)分子的識(shí)別和結(jié)合都是必須的。

(二)DNA復(fù)制的方向：

(1)定點(diǎn)開始雙向復(fù)制：

這是原核生物和真核生物DNA復(fù)制最主要的形式，從一個(gè)特定位點(diǎn)解鏈，沿著兩個(gè)相反的方向各生長出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制泡，用電子顯微鏡可以觀察到復(fù)制泡的存在(圖16－5)。

圖16－5　SV40DNA；復(fù)制泡生長的電鏡圖譜

(2)定點(diǎn)開始單向復(fù)制：

質(zhì)粒colE1是個(gè)典型的例子，復(fù)制從一個(gè)起始點(diǎn)開始，以同一方向生長出兩條鏈，形成一個(gè)復(fù)制叉(replication fork)。

(3)兩點(diǎn)開始單向復(fù)制：

腺病毒DNA的復(fù)制是從兩個(gè)起點(diǎn)開始的，形成兩個(gè)復(fù)制叉，各以一個(gè)單一方向復(fù)制出一條新鏈(圖16－6)。

圖16-6　DNA的半不連續(xù)復(fù)制和復(fù)制泡的形成

總之DNA復(fù)制的起點(diǎn)及方向不僅原核細(xì)胞與真核細(xì)胞不同，就是同屬于原核生物和真核生物的不同種屬也有相當(dāng)大的差異(圖16－7)。

圖16-7　DNA鏈生長方向的三種機(jī)制

(三)DNA復(fù)制起始引發(fā)體的形成及所參與的酶和蛋白質(zhì)：

1.解鏈酶(helicase)

DNA開始復(fù)制時(shí)首先在起始點(diǎn)處解開雙鏈，反應(yīng)是在一種解鏈酶(helicase)的催化下進(jìn)行的。解鏈酶需要ATP分解供給能量。大腸桿菌中DnaB蛋白就有介鏈酶活性，與隨從鏈的模板DNA結(jié)合，沿5′→3′方向移動(dòng)，還有一種叫做Rep蛋白和前導(dǎo)鏈的模板DNA結(jié)合沿3′→5′方向移動(dòng)。解鏈酶的作用就是打開DNA雙鏈之間的氫鍵。

2.單鏈結(jié)合蛋白：(single strand binding proteins,SSBP)

它與解開的單鏈DNA結(jié)合，使其穩(wěn)定不會(huì)再度螺旋化并且避免核酸內(nèi)切酶對(duì)單鏈DNA的水解，保證了單鏈DNA做為模板時(shí)的伸展?fàn)顟B(tài)，SSBP可以重復(fù)利用(圖16－8)。

圖16-8　大腸桿菌DNA復(fù)制叉中復(fù)制過程簡圖

3.引發(fā)體的形成：

DNA復(fù)制起始的關(guān)健步驟是前導(dǎo)鏈DNA的合成，一旦前導(dǎo)鏈DNA的聚合作用開始，隨從鏈DNA的合成也隨著開始。由于前導(dǎo)鏈的合成是連續(xù)進(jìn)行的，所以它的起始相對(duì)簡單，而隨從鏈的合成是不連續(xù)進(jìn)行的，所以引發(fā)階段比較復(fù)雜。大腸桿菌的引發(fā)前體由Dna B. Dna C和單鏈結(jié)合蛋白組成。

(1)引物酶(primase)

它是一種特殊的RNA聚合酶，可催化短片段RNA的合成。這種短RNA片段一般十幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸不等，它們在DNA復(fù)制起始處做為引物。RNA引物的3′桹H末端提供了由DNA聚合酶催化形成DNA分子第一個(gè)磷酸二酯鍵的位置。

(2)引發(fā)體(primosome)

高度解鏈的模板DNA與多種蛋白質(zhì)因子形成的引發(fā)前體促進(jìn)引物酶結(jié)合上來，共同形成引發(fā)體，引發(fā)體主要在DNA隨從鏈上開始，它連續(xù)地與引物酶結(jié)合并解離，從而在不同部位引導(dǎo)引物酶催化合成RNA引物，在引物RNA的3′桹H末端接下去合成DNA片段，這就是隨從鏈不連續(xù)合成的開始。

三、DNA復(fù)制的延長階段以及參與的酶和蛋白質(zhì)分子：

DNA的復(fù)制實(shí)際上就是以DNA為模板在DNA聚合酶作用下，將游離的四種脫氧單核苷酸(dATP,dGTP,dCTP,dTTP,簡寫為dNTP)聚合成DNA的過程。

這是一個(gè)非常復(fù)雜的酶促反應(yīng)，需要許多種酶和蛋白質(zhì)參與，現(xiàn)分別敘述它們在DNA復(fù)制中作用。

(一)DNA的聚合反應(yīng)和DNA聚合酶

圖16－9　DNA聚合酶的作用

1957年，Arthur kornberg首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ，(DNa polymerase Ⅰ,簡寫DNA polⅠ)后來又相繼發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶Ⅱ和DNA聚合酶Ⅲ。(DNa polymerase Ⅱ，Ⅲ，簡寫DNA polⅡ,DNA polⅢ)實(shí)驗(yàn)證明大腸桿菌中DNA復(fù)制的主要過程靠DNa polⅢ起作用，而DNA polⅠ和DNA polⅡ在DNA錯(cuò)配的校正和修復(fù)中起作用。見表16－1。

這種酶的共同性質(zhì)是：①需要DNA模板，因此這類酶又稱為依賴DNA的DNA聚合酶(DNa dependent DNA polymerase, DDDP)。②需要RNA或DNA做為引物(primer)，即DNA聚合酶不能從頭催化DNA的起始。③催化dNTP加到引物的3′桹H末端，因而DNA合成的方向是5′→3′。圖16-9。④三種DNA聚合酶都屬于多功能酶，它們在DNA復(fù)制和修復(fù)過程的不同階段發(fā)揮作用。由于DNA聚合酶Ⅰ是研究得最清楚而且代表了其他DNA聚合酶的基本特點(diǎn)，所以我們著重介紹DNa polⅠ的作用并指出另外二種DNA pol的特殊性：

1.DNA聚合酶Ⅰ：

DNA polⅠ是由一條多肽鏈組成，分子量為109KD。酶分子中含有一個(gè)Zn++，是聚合活性必須的。

大腸桿菌每個(gè)細(xì)胞中約有400個(gè)酶分子，每個(gè)酶分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸參入到DNA鏈中，用枯草桿菌蛋白酶可將此酶水介成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱為klenow片段，小片段為34KD。大小片段具有不同的酶活性。

(1)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性：

這是DNA聚合酶最主要的活性，按模板DNA上的核苷酸順序，將互補(bǔ)的dNTP逐個(gè)加到引物RNA3′桹H末端，并促進(jìn)3′桹H與dNTP的5′桺O4形成磷酸二酯鍵，酶的專一性表現(xiàn)為新進(jìn)入的dNTP必須與模板DNA堿基配對(duì)時(shí)才有催化作用，5′→3′聚合活性存在于klenow片段上(圖16－9和圖16-10)。

圖16-10　DNA聚合酶催化的DNA鏈延長

(2)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性：

這種酶活性的主要功能是從3′→5′方向識(shí)別并切除DNA生長鏈末端與模板DNA不配對(duì)而游離的核苷酸，這種功能稱為校對(duì)功能，這是保證其聚合作用的正確性不可缺少的，因此對(duì)于DNA復(fù)制中極高的保真性是至關(guān)重要的。

(3)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性：

這種酶活性是從DNA鏈的5′端向3′末端水解已配對(duì)的核苷酸，本質(zhì)是切斷磷酸二酯鍵，每次能切除10個(gè)核苷酸。因此，這種酶活性在DNA損傷的修復(fù)中可能起重要作用，對(duì)完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必須的。

DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性協(xié)同作用，可以使DNA一條鏈上的切口從5′→3′方向移動(dòng)，這種反應(yīng)叫做缺刻平移(nick translation)，利用此反應(yīng)可在體外對(duì)DNA片段進(jìn)行放射性磷(α-32PdNTP)的標(biāo)記制成探針(probe)，進(jìn)行核酸的分子雜交實(shí)驗(yàn)，是現(xiàn)代分子生物學(xué)的一項(xiàng)重要技術(shù)(圖16－11)。

圖16-11　缺刻平移標(biāo)記DNA探針

許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)DNA polⅠ并不是DNA復(fù)制過程中的主要酶，它的作用主要與DNA損傷后的修復(fù)有關(guān)。

2.DNA聚合酶Ⅱ(DNA polⅡ)

此酶分子量為120KD，每個(gè)細(xì)胞約有100個(gè)酶分子，但活性只有DNa polⅠ的5%，它具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性，而沒有5′→3′外切活性，它的作用可能與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。

3.DNA聚合酶Ⅲ(DNA polⅢ)

圖16－12　DNA聚合酶Ⅲ催化先導(dǎo)鏈和隨從的合成

這是在DNA復(fù)制過程中起主要作用的聚合酶，它是由一個(gè)多亞基組成的蛋白質(zhì)分子，其分子量＞600kDa整個(gè)酶分子形成一個(gè)不對(duì)稱的二聚體，每個(gè)大腸桿菌細(xì)胞中只有10?0個(gè)酶分子，但催化dNTP參入DNA鏈的速率卻是最快的，約為9000核苷酸/每分鐘/每個(gè)酶分子。這也證明DNa polⅢ是DNA復(fù)制過程中主要發(fā)揮作用的酶。在大腸桿菌染色體DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶Ⅲ全酶并不是單獨(dú)起作用的，而是與引發(fā)體，介鏈酶等構(gòu)成一個(gè)復(fù)制體(replisome)。由于復(fù)制體的存在，先導(dǎo)鏈和隨從鏈可以同時(shí)復(fù)制。DNa polⅢ是由多亞基組成的不對(duì)稱二聚體，它可能同時(shí)負(fù)責(zé)先導(dǎo)鏈和隨從鏈的復(fù)制，在φ×174的復(fù)制中觀察到引發(fā)體總是伴隨著DNA嚕噗(loop)的存在。圖16?2可以看到，由于隨從鏈的模板DNA在DNA聚合酶Ⅲ全酶上繞轉(zhuǎn)了180°而形成一個(gè)嚕噗，因此崗崎片段的合成方向能夠與先導(dǎo)鏈的合成方向以及復(fù)制體移動(dòng)方向保持一致。

隨著DNA polⅢ向前移動(dòng)，先導(dǎo)鏈的合成逐漸延長的同時(shí)，崗崎片段也在不斷延長，這一嚕噗也在不斷擴(kuò)大。當(dāng)崗崎片段合成到前一個(gè)片段的5′端時(shí)，這一大嚕噗就釋放出來，由于復(fù)制叉向前移動(dòng)又可將另一部分隨從鏈的模板置換出來，由引發(fā)體合成新的引物，然后再形成一個(gè)小www.med126.com的嚕噗，進(jìn)行新的崗崎片段的合成。由此模型不難看出：隨從鏈的合成需要周期性的引發(fā)，因此其合成進(jìn)度總是與前導(dǎo)鏈相差一個(gè)崗崎片段的長度。崗崎片段完成后，其5′端的RNA引物由DNa polⅠ的5′→3′外切酶活性切除，由此造成的空隙再由DNA polⅠ的5′→3′聚合活性催化dNTP得到填補(bǔ)。所以DNA的復(fù)制是在DNa polⅢ和DNApolⅠ互相配合下完成的。

下面列表說明三種大腸桿菌DNA聚合酶的特性

表16－1　大腸桿菌DNA聚合酶特征

真核生物DNA聚合酶

真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε。它們的基本特性相似于大腸桿菌DNA聚合酶，其主要活性是催化dNTP的5′→3′聚合活性，基本特征見表16－2。

表16-2　真核生物DNA聚合酶

真核細(xì)胞在DNA復(fù)制中起主要作用的是DNA polα，主要負(fù)責(zé)染色體DNA的復(fù)制。DNa polβ的模板特異性是具有缺口的DNA分子，被認(rèn)為它與DNA修復(fù)有關(guān)。DNa polγ在線粒體DNA的復(fù)制中起作用。DNA polδ不但有5′→3′聚合活性，而且還具有3′→5′外切酶活性，據(jù)認(rèn)為真核生物DNA復(fù)制是在DNa polα和DNA polδ協(xié)同作用下進(jìn)行的，前導(dǎo)鏈的合成靠DNA polδ催化，并且還需要一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子椩鮒誠赴�航z乖?proliferatingcell nucleus antigen, PCNA)參與。而隨從鏈的合成靠DNA polα和引發(fā)酶配合作用完成。

(二)與超螺旋松馳有關(guān)的酶：

DNA復(fù)制從起始點(diǎn)開始向一個(gè)方向復(fù)制時(shí)，局部的DNA雙鏈必須打開，主要靠解鏈酶的作用，打開后的單鏈還需要單鏈結(jié)合蛋白與其結(jié)合，在復(fù)制叉向前移動(dòng)時(shí)造成其前方DNA分子所產(chǎn)生的正超螺旋，必須由拓?fù)洚悩?gòu)酶來解決。下面分別介紹它們的作用。

拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類改變DNA拓?fù)湫再|(zhì)的酶。在體外可催化DNA的各種拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)，而在生物體內(nèi)它們可能參與了DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。在DNA復(fù)制時(shí)，復(fù)制叉行進(jìn)的前方DNA分子部分產(chǎn)生有正超螺旋，拓?fù)涿缚伤神Y超螺旋，有利于復(fù)制叉的前進(jìn)及DNA的合成。DNA復(fù)制完成后，拓?fù)涿赣挚蓪�DNA分子引入超螺旋，使DNA纏繞、折疊，壓縮以形成染色質(zhì)。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶有Ⅰ型和Ⅱ型，它們廣泛存在于原核生物及真核生物中。表16－3

表16－3　大腸桿菌和真核生物中的拓?fù)洚悩?gòu)酶

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(TopoⅠ)的主要作用是將環(huán)狀雙鏈DNA的一條鏈切開一個(gè)口，切口處鏈的末端繞螺旋軸按照松馳超螺旋的方向轉(zhuǎn)動(dòng)，然后再將切口封起來。這就使DNA復(fù)制叉移動(dòng)時(shí)所引起的前方DNA正超螺旋得到緩解，利于DNA復(fù)制叉繼續(xù)向前打開。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ除上述作用外，對(duì)環(huán)狀單鏈DNA還有打結(jié)或解結(jié)作用，對(duì)環(huán)狀雙鏈DNA的環(huán)連或解連以及使環(huán)狀單鏈DNA形成環(huán)狀雙鏈DNA都有作用(圖16－13)。

圖16－１3　拓?fù)涿涪窦阿虻淖饔锰攸c(diǎn)

(a)大腸桿菌拓?fù)涿涪翊呋��?種拓?fù)洚悩?gòu)化作用　(b)拓?fù)涿涪虻淖饔?/p>

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)是在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，曾被稱為旋轉(zhuǎn)酶(gyrase)，它們作用特點(diǎn)是切開環(huán)狀雙鏈DNA的兩條鏈，分子中的部分經(jīng)切口穿過而旋轉(zhuǎn)，然后封閉切口，TopoⅡ還可使DNA分子從超螺旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗神Y狀態(tài)，此反應(yīng)不需要ATP參與。DNA復(fù)制完成后，TopoⅡ在ATP參與下，DNA分子從松馳狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樨?fù)超螺旋。此外，TopoⅡ催化的拓?fù)洚悩?gòu)化反應(yīng)還有環(huán)連或解環(huán)連，以及打結(jié)或解結(jié)。

四、DNA復(fù)制的終止階段

DNA在復(fù)制過程中，合成出的前導(dǎo)鏈為一條連續(xù)的長鏈。隨從鏈則是由合成出許多相鄰的片段，在連接酶的催化下，連接成為一條長鏈。連接作用是在連接酶催化下進(jìn)行的。

連接酶(ligase)的作用是催化相鄰的DNA片段以3′、5′－磷酸二酯鍵相連接。連接反應(yīng)中的能量來自ATP(或NAD＋)。連接酶先與ATP作用，以共價(jià)鍵相連生成E桝MP中間體。中間體即與一個(gè)DNA片段的5′－磷酸相連接形成E-AMP-5′－DNA。然后再與另一個(gè)DNA片段的3′-OHH末端作用，E和AMP脫下，兩個(gè)DNA片段以3′、5′磷酸二酯鍵相連接。隨從鏈的各個(gè)DNA片段就是這樣連接成一條DNA長鏈(圖16-14)。��

圖16-14　連接酶的催化反應(yīng)	圖16－15　真核生物DNA復(fù)制叉結(jié)構(gòu)示意圖

已有研究證明大腸桿菌染色體DNA具有復(fù)制終止位點(diǎn)，此處可以結(jié)合一種特異的蛋白質(zhì)分子叫做Tus，這個(gè)蛋白質(zhì)可能是通過阻止解鏈酶(Helicase)的解鏈活性而終止復(fù)制的。詳細(xì)的機(jī)制還不完全清楚。

DNA復(fù)制完成后，靠拓?fù)涿笇�DNA分子引入超螺旋結(jié)構(gòu)。

五、真核生物DNA復(fù)制的特點(diǎn)：

DNA復(fù)制的研究最初是在原核生物中進(jìn)行的，有些原核生物的DNA復(fù)制已經(jīng)搞得很清楚。真核生物比原核生物復(fù)雜得多，但DNA復(fù)制的基本過程還是相似的。在這里我們主要討論一些重要的區(qū)別。

圖16－16　端粒酶催化端區(qū)TG鏈的合成

1.與原核生物不同，真核生物DNA復(fù)制有許多起始點(diǎn)，例如酵母S.cerevisiae的17號(hào)染色體約有400個(gè)起始點(diǎn)，因此，雖然真核生物DNA復(fù)制的速度(60核苷酸/每秒鐘)比原核生物DNA復(fù)制的速度(E.coli1700核苷酸/每秒鐘)慢得多，但復(fù)制完全部基因組DNA也只要幾分鐘的時(shí)間。

2.SV40病毒DNA主要依靠宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制體系進(jìn)行DNA的復(fù)制，這是了解真核生物DNA復(fù)制的體外模型。在真核生物DNA復(fù)制叉處，需要兩種不同的酶。DNA聚合酶α(polα)和DNA聚合酶δ(polδ)。polα和引物酶緊密結(jié)合，在DNA模板上先合成RNA引物，再由polα延長DNA鏈，這種活性還要復(fù)制因子C參與。同時(shí)結(jié)合在引物模板上的PCNA(增殖細(xì)胞核抗原Proliferating cell nuclear antigen)此時(shí)釋放了polα，然后由polδ結(jié)合到生長鏈3′末端，并與PCNA結(jié)合，繼續(xù)合成前導(dǎo)鏈。而隨從鏈的合成靠polα緊密與引物酶結(jié)合并在復(fù)制因子C幫助下，合成崗崎片段(圖16－15)。

3.由于真核生物染色體是線性DNA，它的兩端叫做端區(qū)(telomeres)，端區(qū)是由重復(fù)的寡核苷酸序列構(gòu)成的。例如酵母的端區(qū)重復(fù)序列是5′G(1?)T(3)3′。前面講到所有生物DNA聚合酶都只能催化DNA從5′→3′的方向合成，因此當(dāng)復(fù)制叉到達(dá)線性染色體末端時(shí)，前導(dǎo)鏈可以連續(xù)合成到頭，而由于隨從鏈?zhǔn)且砸环N不連續(xù)的形式合成崗崎片段，所以不能完成線性染色體末端的復(fù)制，如果這個(gè)問題不解決，真核生物在細(xì)胞分裂時(shí)DNA復(fù)制將產(chǎn)生5′末端隱縮，使DNA縮短，近十多年的研究表明，真核生物體內(nèi)都存在一種特殊的反轉(zhuǎn)錄酶叫做端粒酶(telomerase)，它是由蛋白質(zhì)和RNA兩部分組成的，它以自身的RNA為模板，在隨從鏈模板DNA的3′桹H末端延長DNA，再以這種延長的DNA為模板，繼續(xù)合成隨從鏈(圖16－16)。

由此可見端粒酶在保證染色體復(fù)制的完整性上有重要意義。