2012年度執(zhí)業(yè)藥師考試藥物分析復(fù)習(xí)資料—色譜法

色譜法
色譜法是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。先將混合物中各組分分離而后逐個分析，是分析化合物有力手段。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。
第一節(jié) 概論
一、基本原理
色譜過程是物質(zhì)分子在相對運動的兩相(固定相和流動相)間分配平衡的過程，可用分配系數(shù)K和容量因子k描述。醫(yī),學(xué).全,在.線m.payment-defi.com
1.分配系數(shù)K=Cs/Cm，與組分、固定相和流動相性質(zhì)和溫度有關(guān)。
2.容量因子k＝Ws/Wm，不僅與組分、固定相和流動相性質(zhì)和溫度有關(guān)，還與兩相體積有關(guān)。容量因子不等是色譜分離的先決條件。
3.色譜過程方程：保留時間與分配系數(shù)關(guān)系tR=t0(1+k)
二、分類
1．按分離原理
(1) 吸附色譜法：固定相為固體
(2) 分配色譜法：固定相為液體
(3) 離子交換色譜法：固定相為離子交換樹脂
(4) 分子排阻色譜法：固定相為多孔填料
2．按操作形式：平面色譜、柱色譜、電泳法
3．按兩相物態(tài)：氣相色譜、液相色譜
第二節(jié) 薄層色譜法
一、基本原理
吸附劑對不同組分A和B具有不同吸附能力，展開劑也對A和B有不同溶解、解吸能力，當(dāng)展開劑不斷展開，A、B在吸附劑和展開劑之間連續(xù)不斷吸附解吸，產(chǎn)生差速遷移得到分離。
二、固定相
1．硅膠：含水量越高，活性越低，吸附力越弱。在105～110℃加熱30min，使其活化。硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、硅膠HF254的含義
2．氧化鋁：堿性、中性和酸性三種。活性與含水量有關(guān)
3．聚酰胺：可與酚羥基、羧基、氨基酸形成氫鍵，選擇性高
三、操作方法
1．制備：1份固定相與3份水混和涂布，110℃烘30分鐘
2．點樣與展開：點樣一般為直徑2～4mm圓點，距底2.0cm；展開距離一般為10～15cm。
3．檢視：熒光板在紫外光下檢視；普通薄層板用物理方法或顯色劑顯色。
4．系統(tǒng)適用性試驗
比移值：Rf＝l/l0，為組分遷移距離與展開劑遷移距離之比
比移值的最佳范圍是0.3～0.5，可用范圍是0.2～0.8。
影響比移值因素：①被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。極性較強的組分Rf較小。②薄層板性質(zhì)。吸附劑活性越強，Rf較小。③展開劑性質(zhì)。極性越強展開劑Rf值增大④展開劑蒸氣飽和程度。
3.分離度：R=2d/(W1+W2)，兩相鄰斑點中心距離與兩斑點平均寬度的比值
四、應(yīng)用醫(yī),學(xué).全,在.線m.payment-defi.com
1.鑒別：比較供試品與對照品溶液的比移值
2.雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對照品比較法；自身稀釋對照法
第三節(jié) 高效液相色譜法
一、基本原理
1．基本概念
色譜峰參數(shù)：峰高或峰面積(用于定量)，峰位(保留值表示，用于定性)，峰寬(用于衡量柱效)
保留值：保留時間、死時間、調(diào)整保留時間
峰寬：標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬、峰寬
2.塔板理論：把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇的在單個塔板中的分配平衡過程
理論塔板數(shù)  n=5.54(tR/Wh/2)2
色譜柱的理論塔板數(shù)越多，柱效越高；同樣長度中塔板高度越小，柱效越高。
3.速率理論：主要說明使色譜峰擴張而降低柱效的因素
范氏方程     H=A+B/μ+Cμ
A為渦流擴散項。采用適當(dāng)粒度、均勻的填料并填充均勻可減小渦流擴散
B為縱向擴散系數(shù)。流動相為液體，柱溫為室溫，B/μ可忽略不計
C為傳質(zhì)阻抗系數(shù)。在能完全覆蓋載體表面的前提下，應(yīng)適當(dāng)減少固定液用量。
二、高效液相色譜儀
1.高壓輸液泵
2.色譜柱：分析型和制備型
3.進樣閥
4.檢測器
（1)選擇性檢測器：與待測物濃度、結(jié)構(gòu)有關(guān)
①紫外檢測器：靈敏度、重復(fù)性及線性范圍較好，適用于具有共軛結(jié)構(gòu)的化合物的檢測
②光二極管陣列檢測器：檢測原理相同，可同時記錄待測物吸收光譜，用于光譜鑒定和純度檢查
③熒光檢測器：靈敏，用于在流動相條件下具有熒光或經(jīng)衍生轉(zhuǎn)化為具有熒光的化合物的檢測
④電化學(xué)檢測器：靈敏度高，僅用于在流動相條件下發(fā)生氧化－還原反應(yīng)的化合物
⑤質(zhì)譜檢測器：高靈敏度、高選擇性、分析范圍廣；不適用于小分子化合物，主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽的檢測
（2)通用性檢測器：質(zhì)量型檢測器
①示差折光檢測器：僅對少數(shù)物質(zhì)如糖類靈敏度較高，受環(huán)境溫度影響大，實際應(yīng)用少
②蒸發(fā)光散射檢測器：適用于UV檢測困難的物質(zhì)的分析，響應(yīng)值與濃度通常不呈線性關(guān)系。
三、吸附色譜法
1．原理：被分離組分與流動相對吸附劑吸附能力的差異
2．常用固定相和流動相
固定相：硅膠、氧化鋁、高分子多孔微
流動相：烷烴加極性調(diào)節(jié)劑；極性越強，洗脫能力越強
四、分配色譜法
1．原理：被分離組分溶入互不相溶的固定相與流動相，達到平衡后濃度之比（分配系數(shù))的差異
正相分配色譜：流動相極性小于固定相極性。極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。用于分離極性及中等極性物質(zhì)醫(yī),學(xué).全,在.線m.payment-defi.com
反相分配色譜：流動相極性大于固定相極性。極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。應(yīng)用廣泛，用于分離非極性至中等極性物質(zhì)
離子對反相色譜：在流動相中加入有機離子對試劑，用于有機酸、堿、鹽的分離
離子抑制色譜：調(diào)整流動相pH，抑制組分的解離
2．常用固定相和流動相
（1)固定相：化學(xué)鍵合相
非極性：十八烷基硅烷鍵合硅膠
極性：氨基和氰基硅烷鍵合相
（2)流動相
正相色譜：烷烴加極性調(diào)節(jié)劑
反相色譜：甲醇－水、乙腈－水
五、色譜系統(tǒng)適用性試驗
固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變，其余可適當(dāng)改變以達到色譜系統(tǒng)適用性試驗要求
1.理論塔板數(shù)：不得低于各品種項下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)
2.分離度：除另有規(guī)定外，分離度應(yīng)大于1.5
3.重復(fù)性：取各品種項下對照品2連續(xù)進樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0％
4.拖尾因子：除另有規(guī)定外，拖尾因子應(yīng)在0.95～1.05之間
六、應(yīng)用
1.鑒別：利用保留值進行鑒別。
2.檢查
(1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)含量
(2) 外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)含量
(3) 加校正因子的主成分自身對照法
(4) 不加校正因子的主成分自身對照法
(5) 面積歸一化法：一般不用于微量雜質(zhì)檢查
3.含量測定：外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)法
內(nèi)標(biāo)物要求：①原樣品中不含有的組分；②保留時間與待測組分相近，但能完全分離；③純度合乎要求。
第四節(jié)  氣相色譜法
一、基本原理
以氣體為流動相的色譜法，具有分離效能高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點，不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分析。
分類：吸附色譜和分配色譜；氣－固色譜和氣－液色譜；填充柱色譜和毛細(xì)管色譜
二、氣相色譜儀
1.氣源：FID常用載氣多為氮氣或氦氣；TCD多用氦氣或氫氣為載氣；ECD多用氮氣或氬氣
2.進樣方式：溶液直接進樣；頂空進樣
3.色譜柱和柱溫箱：填充柱和毛細(xì)管柱
4．檢測器
火焰離子化檢測器FID：靈敏度高、響應(yīng)快、線性范圍寬，最常用。
氮磷檢測器NPD：適用于含氮、磷元素的藥物
火焰光度檢測器FPD：適用于含磷、硫元素的藥物
電子捕獲檢測器ECD：主要用于含鹵素的藥物
質(zhì)譜檢測器MS：高靈敏度、高專屬性，可用于結(jié)構(gòu)確證
熱導(dǎo)檢測器TCD：構(gòu)造簡單、測定范圍廣、樣品不破壞，但靈敏度較低。
三、常用固定液與載體
1．固定液
烴類：標(biāo)準(zhǔn)非極性固定液
硅氧烷類：通用型固定液
醇類：氫鍵型固定液
2．載體：化學(xué)惰性的多孔微粒，常用硅藻土
3．毛細(xì)管色譜柱
開管型：涂壁毛細(xì)管柱、載體涂層毛細(xì)管柱
填充型
四、色譜系統(tǒng)適用性試驗醫(yī),學(xué).全,在.線m.payment-defi.com
檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜材料不得改變。
五、應(yīng)用
標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法：配制雜質(zhì)對照品溶液，精密加入到供試品中，測定雜質(zhì)含量，再扣除加入對照品溶液量。
采用頂空進樣時，該法可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。該法與其他方法結(jié)果不一致時以本法結(jié)果為準(zhǔn)。
第五節(jié) 電泳法
一、基本原理
電泳遷移速度   ν＝μE
在相同電場強度下，兩組分分離程度取決于二者淌度之差。電泳分離后各組分的相對位置由組分的電泳泳動和緩沖液電滲共同決定。
影響電泳分離的條件包括：
1.緩沖液的pH值和離子強度：pH直接影響組分的荷電情況，是電泳分離的最重要條件。離子強度太小則緩沖容量不足，區(qū)帶易擴散；太大則組分移動慢，發(fā)熱嚴(yán)重。
2.電場強度：電場強度越大分離越完全，大于20V/cm時發(fā)熱嚴(yán)重。
3.樣品濃度：通常以1％為宜。太濃拖尾，太稀測定結(jié)構(gòu)精密度差。
二、各類電泳法
1.紙電泳法
2.醋酸纖維素電泳法
3.瓊酯糖凝膠電泳法
4.聚丙烯酰胺凝膠電泳法
5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法
三、毛細(xì)管電泳法
以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力，依照樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實現(xiàn)分離的方法。
1．毛細(xì)管區(qū)帶電泳
2．毛細(xì)管凝膠電泳
3．毛細(xì)管等速電泳
4．毛細(xì)管等電聚焦電泳
5．膠束電動毛細(xì)管色譜
6．毛細(xì)管電色譜
第七章 藥物的雜質(zhì)檢查
第一節(jié) 雜質(zhì)和雜質(zhì)的限量檢查
一、雜質(zhì)來源和分類
1.雜質(zhì)是指藥物中存在的無治療作用或影響藥物的穩(wěn)定性和療效，甚至對人健康有害的物質(zhì)。
2.雜質(zhì)的來源，主要有兩個：
一是由生產(chǎn)過程中引入。（精制未能完全除去，原料不純或存在反應(yīng)不完全，中間產(chǎn)物與副產(chǎn)物)。
二是在貯藏過程中產(chǎn)生。（貯藏過程外界條件影響，或因微生物的作用，發(fā)生水解、氧化、分解、異構(gòu)化、晶型轉(zhuǎn)變、聚合、潮解和發(fā)霉等變化，產(chǎn)生有關(guān)的雜質(zhì))。
3.雜質(zhì)按來源分類，可分為一般雜質(zhì)和特殊雜質(zhì)。一般雜質(zhì)是指在自然界中分布較廣泛，在多種藥物生產(chǎn)和貯藏過程中容易引入的雜質(zhì)，如酸、堿、水份、氯化物、硫酸鹽等。一般雜質(zhì)檢查方法收載在藥典附錄中。特殊雜質(zhì)是指在個別藥物的生產(chǎn)和貯藏過程中引入的雜質(zhì)，檢查方法收載在該藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。
雜質(zhì)按其性質(zhì)還可分為信號雜質(zhì)和有害雜質(zhì)，信號雜質(zhì)本身一般無害，其含量多少可以反映出藥物純度水平。有害雜質(zhì)如重金屬、砷鹽，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要嚴(yán)格控制，以保證用藥安全。
二、雜質(zhì)的限量檢查
由于雜質(zhì)不可能完全除盡，所以在不影響療效和不發(fā)生毒性的原則下，既保證藥物質(zhì)量，又便于制造、貯藏和制劑生產(chǎn)，對于藥物中可能存在的雜質(zhì)，允許有一定限量，通常不要求測定其準(zhǔn)確含量�！端幍洹分幸�(guī)定的雜質(zhì)檢查均為限量（或限度)檢查。
雜質(zhì)限量：指藥物中所含雜質(zhì)的最大容許量。
表示方法：通常用百分之幾或百萬分之幾(ppm)來表示。對危害人體健康、影響藥物穩(wěn)定性的雜質(zhì)，必須嚴(yán)格控制其限量。檢查時可用雜質(zhì)的純品或?qū)φ掌吩谙嗤瑮l件下來比較。
限量計算：雜質(zhì)限量=雜質(zhì)最大允許量/供試品量 ×100%
=標(biāo)準(zhǔn)溶液體積×標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/供試品 ×100%
        或 L=V×C/S ×100%

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