| 公開(公告)號 | CN1242065C |
| 公開(公告)日 | 2006.02.15 |
| 申請(專利)號 | CN200310112770.7 |
| 申請日期 | 2003.12.26 |
| 專利名稱 | 豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒和疫苗 |
| 主分類號 | C12N15/861(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/861(2006.01)I;C12N7/08(2006.01)I;C12N15/09(2006.01)I;C12N15/33(2006.01)I;C12N15/85(2006.01)I;A61K39/235(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 姜 平;李玉峰 |
| 地址 | 210095江蘇省南京市衛(wèi)崗1號南京農(nóng)業(yè)大學(xué)科技處錢寶英 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 |
| 代理人 | 樓高潮 |
| 國省代碼 | 江蘇;32 |
| 主權(quán)項 | 豬繁殖與呼吸綜合征重組腺病毒，是通過以下方法構(gòu)建而成的：(1)GP5基因的擴增、克隆根據(jù)PRRSV美洲標(biāo)準(zhǔn)毒株ATCCVR-2332的基因序列設(shè)計了一對針對PRRSV國內(nèi)分離株S1毒株GP5基因的特異性引物，引物序列如下：AdGP5.1：5-GCCGGTACCACCATGTTGGAGAAATGCTTGAC-3AdGP5.2：5-GCACTCGAGCTAAGGACGACCCCATTGTTC-3以S1毒株感染的Marc-145細(xì)胞的cDNA產(chǎn)物為模板，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增出了PRRSV國內(nèi)分離株S1毒株的GP5全基因，在引物的5’端分別含有限制性內(nèi)切酶酶切位點，通過這兩個酶切位點，把GP5基因克隆入穿梭載體pShuttle-CMV中，然后通過酶切和PCR鑒定，獲得含有GP5基因的穿梭載體pShuttle-CMV-GP5；(2)含有GP5基因的穿梭載體pShuttle-CMV-GP5與腺病毒骨架載體pAdEasy-1同源重組鑒定好的含有GP5基因的穿梭載體pShuttle-CMV-GP5經(jīng)酶切線性化后與腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BJ5183中，在大腸桿菌重組酶的作用下，在穿梭載體和骨架載體之間發(fā)生同源重組，實現(xiàn)了把外源基因轉(zhuǎn)入腺病毒骨架載體，經(jīng)50g/ml卡那霉素篩選獲得了含有外源基因的重組腺病毒質(zhì)粒；(3)重組腺病毒的獲得鑒定好的重組腺病毒質(zhì)粒通過陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞，重組腺病毒質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)包裝成完整的重組腺病毒rAd-GP5。 |
| 摘要 | 本發(fā)明豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)重組腺病毒和疫苗屬于高新生物技術(shù)領(lǐng)域。通過RT-PCR技術(shù)擴增PRRSV GP5全基因序列，并把該基因序列克隆入腺病毒載體系統(tǒng)的穿梭載體pShuttle-CMV中，與腺病毒載體系統(tǒng)的骨架載體pAdEasy-1共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183菌株獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293-A細(xì)胞獲得了重組腺病毒并成功的進(jìn)行了噬斑純化，通過RT-PCR和間接免疫熒光技術(shù)證明構(gòu)建成功表達(dá)了PRRSV GP5蛋白的重組腺病毒rAd-GP5。在該重組毒中可以使PRRSV的GP5蛋白表達(dá)提前和表達(dá)量提高，能更有效的刺激機體的免疫保護(hù)反應(yīng)。這種重組腺病毒疫苗具有亞單位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力，能夠刺激機體全方位的免疫應(yīng)答，從而具有廣泛的開發(fā)和應(yīng)用前景。 |
| 國際公布 |
